인유두종 바이러스 E6 억제 RNA가 자궁경부암 세포주(SiHa cell)의 생존에 미치는 영향
저자
발행사항
광주 : 조선대학교, 2004
학위논문사항
학위논문(박사)-- 조선대학교 대학원 : 의학과 2005.2
발행연도
2004
작성언어
한국어
주제어
DDC
610
발행국(도시)
광주
기타서명
Effect of HPV 16 E6 siRNA on viability of SiHa cell line
형태사항
46p : 삽도 ; 27cm.
일반주기명
지도교수: 이병래
소장기관
서론 : 자궁경부암은 우리나라 여성에서 흔한 암으로, 확실한 발병기전은 밝혀지지 않으나, 대부분의 자궁경부암이 고위험군 HPV 감염과 밀접한 관련이 있는 것으로 알려져 있다. 지금까지 알려진 HPV의 발암 기전은 HPV DNA가 인간의 DNA에 끼워들어 합쳐져서 HPV의 E6와 E7 단백질이 숙주세포의 p53이나 pRB와 같은 종양 억제 단백질과 결합하여 이를 비활성화 시킴으로써 암을 유발하는 것으로 알려져 있다. 즉 E6와 E7 단백질은 암 억제 유전자의 기능인 세포주기의 조절, 손상 DNA의 자가치유, 세포자멸사 (apoptosis)의 유도 및 분화의 촉진 등의 기능을 억제시킨다. 진핵세포에서 이중 사슬 RNA (double strand RNA:dsDNA)는 mRNA 파괴, 전사억제 및 전이억제 작용을 나타낼 수 있는데, 상응하는 염기서열(homologous base sequence)이 있는 mRNA를 파괴하는 것을 RNA 간섭현상 (RNA-mediated interference: RNAi) 이라 한다. RNA 간섭현상은 대표적인 전사 후 유전자 발현 억제 (post transcriptional gene silencing : PTGS) 기전으로 알려져 있다. RNA 간섭현상은 dsRNA를 이용하여 그 RNA에 상응하는 특정 유전자의 mRNA을 선택적으로 분해함으로써 유전자 발현을 정지(silencing)시키는 것이 기본 원리이다. RNA 간섭 현상은 1998년에 Andrew Fire와 Craig Mello가 C. elegans에서 anti-sense RNA를 연구하던 중에 처음으로 발견하여 보고되었고, 이후 초파리, 식물에서도 확인되었으며, 최근에는 동물세포나 인간세포에서도 같은 현상이 일어나는 것으로 보고되었다. RNAi를 이용하여 mRNA를 분해시켜 특정 유전자의 발현을 저해하는 knock-down 현상이 동물세포 및 사람세포에서 나타나는 것이 확인되었는데, RNAi를 이용한 knock-down 유도기술은 생명과학분야의 연구에서 매우 유력한 도구가 될 수 있을 뿐만 아니라 특히 암과 바이러스성 질병을 치료하기 위한 새로운 치료법 개발에 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
방법 : 암의 유전자 치료법 개발의 일환으로 암의 발생뿐만 아니라 암의 유지에도 매우 중요한 것으로 알려져 있는 E6 유전자를 표적으로 하는 실험을 인유두종 바이러스 16 형 E6 유전자 발현이 일어나는 인간 자궁암 세포주인 SiHa (HPV 16+) 세포에서 E6 siRNA를 이용하여 실시하였다.
결과
1. SiHa (HPV 16+) 세포에서 E6 siRNA로 형질전환 시키면 E6 유전자 mRNA 량이 억제됨을 알 수 있었다.
2. E6 siRNA로 형질전환 시킨 세포의 p53 mRNA 량은 변화가 없었다.
3. E6 siRNA로 형질전환 시킨 세포의 p53 단백질 량은 감소되었다.
4. E6 siRNA로 형질전환 시킨 세포의 성장은 억제 되었다.
결론 : 이상의 실험결과 SiHa 세포에서 HPV 16 E6 siRNA를 이용한 세포 성장의 감소는 HPV 16 E6 siRNA가 E6를 억제함으로써 p53의 억제가 저하되어 세포사가 유도되어 나타난 결과로 추측된다. 이러한 HPV 16 E6 siRNA의 작용은 SiHa 포에서 HPV 16 E6 siRNA가 E6 유전자의 발현을 knock-down 시켜 나타난 결과로 생각되므로, HPV 16 E6 siRNA가 배양세포에서 유전자 발현 억제작용이 나타나는 것으로 추정된다. 또한 HPV 16 E6 siRNA의 세포 성장 억제 효과는 HPV 16 E6 siRNA의 암 세포 성장 억제 가능성을 시사하므로 암의 유전자 치료의 표지 유전자(target gene) 이용될 수 있을 것으로 생각되고, 동물실험 등의 생체실험을 통하여 같은 현상이 생체에서도 일어날 수 있는지를 확인 하여야 할 것으로 사료된다.
Background : Human papilloma virus (HPV) infection has been strongly associated with pathogenesis of uterine cervix carcinoma. HPV type 16, a causative agent of uterine cervix carcinoma, encodes the E6 and E7 oncogenes, whose expression is pivotal for malignant transformation and maintenance of malignant phenotypes.
Objective : To develop a gene therapy for HPV-related carcinoma, this experiment investigated the effect of E6 short-interfering RNA (siRNA) on the expression of this oncogene and on the cell growth of HPV 16-related cervical carcinoma cells. SiHa cells, a uterine cervix carcinoma cell line, contain a single copy of HPV 16 integrated in the chromosome and express the E6 and E7 oncogenes.
Methods : An HPV 16-genome-positive cell line (SiHa) was cultured in DMEM (Dulbecco's modified eagle medium) containing 5% FBS (fetal bovine serum) at 37℃ and 5% CO2. 24 hr's before transfection, cells were seeded and constructed with expression plasmid and various amounts of siRNA using a Lipofectamine transfection reagent. mRNA was analysed by RT-PCR and p53 level was determined by immunoblotting. Cells growing rates was investigated by MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-4yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) methods.
Results: The E6 mRNA level in SiHa cells were decreased in HPV 16 E6 siRNA expression vector transfected cells. The p53 protein level were decreased cell by HPV 16 E6 siRNA expression vector transfection. The growth of SiHa cells were decreased by HPV 16 E6 siRNA expression vector transfection.
Conclusion : From these results, E6 siRNA suppressed growth of SiHa cells, which was may be associated with p53 protein and HPV E6 siRNA has some possibility as a candidate for gene-specific therapy for HPV-related uterine cervix carcinoma.
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