Fruit extracts of sea buckthorn (Hippophae rhamnoides) promote the osteogenic differentiation in C3H10T1/2 cells and prevent osteoporosis in ovariectomized mice
저자
발행사항
Seoul : Sungkyunkwan University, 2023
학위논문사항
Thesis (Ph.D.)-- Sungkyunkwan University : Department of Food Science and Biotechnology 2023. 2
발행연도
2023
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
서울
기타서명
C3H10T1/2 세포 내에서 조골세포 분화를 촉진하고 난소절제 마우스모델 내에서 골다공증을 예방하는 산자나무(Hippophae rhamnoides) 열매 추출물의 효과
형태사항
ix, 127 p. : ill.(some col.), charts ; 30 cm
일반주기명
Advisor: Ki-Moon Park
Includes bibliographical reference(p. 106-125)
UCI식별코드
I804:11040-000000174171
DOI식별코드
소장기관
The fruit of Hippophae rhamnoides (H. rhamnoides) has been widely used for medicinal purposes because of its anti-inflammatory, anti-oxidant, anti-platelet, and antimicrobial effects. Since there are no clear reports on the therapeutic efficacy of H. rhamnoides in osteoporosis, this study aimed to confirm the potential use of H. rhamnoides for the treatment of osteoporosis through its osteogenic differentiation-promoting effect in ovariectomized mice. Through an in vitro study, the ethanol extract of H. rhamnoides fruits (EHRF) significantly stimulated the differentiation of mesenchymal stem cells into osteoblasts and showed 7.5 times (p < 0.05) higher osteogenesis than in the untreated control. A solvent fractionation process of EHRF showed that the hexane-soluble fraction (HRH) showed 10.4 times (p < 0.01) higher osteogenesis than in the untreated control. Among the sub-fractions derived from the active HRH by preparative HPLC fractionation, HRHF4 showed 7.5 times (p < 0.05) higher osteogenesis than in the untreated naïve cells, and HRH and HRHF4 fractions showed 22.6 times (p < 0.001) stronger osteogenesis activity than in the negative control. Osteoporosis was induced by excision of both ovaries in 9-week-old female ICR mice for in vivo analysis, and two active fractions, HRH and HRHF4, were administered orally for three months. During the in vivo study, the average BMD of the ovariectomized group decreased by 0.0009 g/cm2, whereas the average BMD of the HRH intake group increased by 0.0033 g/cm2 (p < 0.05) and that of the HRHF4 intake group increased by 0.0059 g/cm2 (p < 0.01). The HRH and HRHF4 intake groups significantly recovered the mRNA and protein expression of osteogenic genes, including ALP, Osteopontin, Runx2, and Osterix, in the osteoporosis mouse tibia.
HRHF4_F3_S9, which showed the highest promotion effect in osteoblast differentiation among the twelve candidate single compounds, was found to be Ursolic aldehyde with a molecular formula of C30H48O2 and a molecular weight of 440.7. To summarize all the studies, active substances, including ursolic aldehyde in the EtOH extract of the H. rhamnoides fruits, are involved in the differentiation process of osteoblasts in vivo to express osteogenic biomarkers to prevent or treat osteoporosis. Taken together, H. rhamnoides fruits will be in the spotlight as a novel nature-derived drug for the prevention and treatment of osteoporosis.
산자나무(Hippophae rhamnoides)의 열매는 항염증, 항산화, 항혈소판, 항균작용 등의 약용 효과가 있어 널리 사용되어 왔지만, 골다공증 예방 및 치료에 미치는 효능에 관한 연구결과가 아직 보고되지 않았다. 그래서 본 연구는 세포실험과 동물실험을 통해 산자나무 열매가 골다공증 치료제로서 사용 가능한지 여부를 확인하는 것을 연구목표로 하였다. 먼저, in vitro 연구를 통해 마우스 중간엽 줄기세포주 C3H10T1/2의 분화과정에 산자나무 열매의 에탄올 추출물(EHRF)이 나타내는 효과를, ALP 염색결과와 골형성 관련 유전자의 상대적 발현량을 바탕으로 비교하였다. 에탄올 추출물은 조골세포 분화를 유의적으로 촉진하였으며, 음성대조군보다 7.5배 (p < 0.05) 높은 효능을 나타냈다. 에탄올 추출물을 유기용매 분획하여 얻은 헥세인 분획층(HRH)은 음성대조군보다 10.4배 (p < 0.01) 높은 효능을 나타냈다. Prep HPLC 분획에 의해 HRH에서 얻은 하위 분획층 (HRHF1 ~ F4)중에서 HRHF4는 음성대조군과 비교해 22.6배(p < 0.001)로 가장 높은 활성을 나타냈다.
9주령 암컷 ICR 마우스의 양쪽 난소를 절제한 뒤 3개월 간 골다공증을 유도하였고, 두가지 종류의 활성 분획 HRH와 HRHF4를 이후 3개월 동안 매일 경구투여하였다. 투여 기간 동안 난소를 절제한 그룹(OVX)의 평균 골밀도 수치가 0.0009 g/cm2 감소한 반면, HRH를 섭취한 그룹의 평균 골밀도 수치는 0.0033 g/cm2 (p < 0.05), HRHF4를 섭취한 그룹의 평균 골밀도는 0.0059 g/cm2 (p < 0.01) 증가했다. 활성 분획을 섭취한 두 그룹은, 동물실험 후 분리한 마우스 경골 샘플에서 골형성 관련 유전자와 단백질의 발현을 유의적으로 회복하였다. 이러한 연구 결과는 산자나무 열매의 활성 분획이 조골세포 분화를 유의미하게 촉진하고 골형성 유전자의 발현을 증가시켜 골다공증 유도 마우스 모델의 골밀도를 향상시켰음을 나타낸다.
Semi-prep HPLC를 통해 분리한 12개의 후보 단일 물질 중에서 조골세포 분화 촉진 효능이 가장 높게 나타난 HRHF4_F3_S9 compound는 분자식이 C30H48O2이고 분자량이 440.7인 우르솔릭 알데하이드(ursolic aldehyde)라는 물질로 나타났다. 연구 내용을 모두 종합하면, 산자나무 (H. rhamnoides) 열매의 에탄올 추출물에 있는 ursolic aldehyde를 비롯한 골형성 관련 활성물질들이 마우스 내에서 조골세포의 분화 과정에 관여하여, 골다공증을 예방하거나 치료하기 위한 골형성 바이오마커를 발현시키는 것을 확인하였다. 본 연구의 결과와 추가 연구를 통해 산자나무 열매추출물이 천연에서 유래한 새로운 골다공증 치료제로 주목받을 것이라고 기대된다.
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