Effect of scopoletin on melanogenesis through cyclic AMP signaling pathway and photoaging improvement = Scopoletin이 cyclic AMP 경로를 통한 멜라닌 합성 조절과 광노화 개선 효과

국문 초록 (Abstract)

피부는 성인 체중의 약 16%를 차지하며 전신을 덮고 있는 일 차 방어선으로서 인체에서 가장 큰 기관이다. 피부의 가장 중요한 생리적인 기능은 외부의 물리적 및 화학적 변화를 완충시켜 신체 내부기관을 보호하고 항상성 유지시키는 일차적인 방어기능을 담당하는 것이다. 이를 위해 분비, 배설, 체온조절, 물질 흡수작용 및 비타민 D 합성 등의 작용을 한다. 또한 피부는 신체 내부의 기능과 긴밀한 상호작용을 통해 인체가 정상적인 활동을 유지하는데 매우 중요한 역할을 수행하고 있다.
최근 오존층 파괴와 같은 지구 환경변화로 인해 피부는 자외선에 더 많이 노출되고 있으며, 이로 인해 인체의 일차 방어 벽인 피부의 건강이 위협받고 있다. UV는 파장에 따라 UVA, UVB, UVC로 구분되며, 이 중 UVB(290-320 nm)는 주로 표피에 영향을 주어 피부손상을 일으킨다. UVB는 다양한 경로를 통해 ROS생성을 유도하고 피부에 산화적 스트레스를 초래하여 피부노화와 홍반, 부종 등의 피부염증을 유발하고 심하면 피부암으로 진행되기도 한다.
Scopoletin(6-methoxy-7-hydroxycoumarin)은 인진호(Artemisiae Capillaris Thunberg), 노니(Morinda citrifolia L.), 구릿대(Angelica dahurica) 등에 함유되어 있다. 최근 보고된 scopoletin의 효능은 항염증, 아세틸콜린 분비의 유도, 간 보호 효과, 신생혈관생성 억제, HepG2 세포에서 인슐린 저항성 개선, 항산화 효과 등이 있다.
CHAPTER Ⅰ. Scopoletin 이 cyclic AMP 신호전달 경로를 통한 멜라닌 합성 조절에 미치는 영향

멜라닌은 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌 세포에서 생산되고 주변의 각질형성세포로 전이되어 피부색을 나타내며, 자외선의 피부 침투를 차단하고 DNA 손상을 막아준다. 멜라닌 합성에 관여하는 효소로는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질이 잘 알려져 있으며, 주요한 세포 내 신호전달 경로는 cAMP, protein kinase C(PKC), p38 경로가 있다. 이 중 cAMP 경로는 하위의 PKA를 경유하여 CREB을 활성화시키고, tyrosinase, TRP-1, TRP-2 전사를 촉진하는 인자인 MITF의 발현을 촉진시킨다. 이러한 일련의 반응을 통해 합성되는 멜라닌 색소가 결핍되는 질병에는 백색증, 면역반응의 이상으로 인한 백반증 (vitiligo), 유전자 변형에 의한 바르덴부르크 증후군 (waardenburg syndrome) 등이 있다.
본 연구는 coumarin 유도체인 scopoletin이 멜라닌 합성에 미치는 영향과 신호전달 경로를 조사 하였다. Scopoletin을 B16F10 흑색종 세포주에 20, 40 μg/ml로 처리하고 3일간 배양한 후 멜라닌 합성양과 tyrosinase 활성을 조사하였다. 실험 결과 scopoletin은 농도의존적으로 멜라닌 합성을 증가시켰으며, tyrosinase 활성을 현저하게 증가 시켰다. 또한 면역형광염색을 통하여 세포 수준에서 tyrosinase 발현을 관찰한 결과 핵 주위에서만 일부 발현되던 tyrosinase가 scopoletin에 의해 발현 양이 증가하였을 뿐만 아니라 가지돌기 및 세포질에 고루 분포되어 발현되었다. Western blot을 이용하여 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 단백질 발현을 조사한 결과 scopoletin은 tyrosinase와 TRP-1 단백질 발현을 증가시켰고, RT-PCR 실험 결과 tyrosinase mRNA 발현 또한 증가시킴이 확인되었다.
멜라닌 합성 신호전달 경로로 잘 알려져 있는 cAMP 경로가 scopoletin에 의한 멜라닌 합성 유도와 관련이 있는지 조사하기 위하여 p-CREB과 MITF 발현을 확인하였다. 실험 결과 scopoletin은 p-CREB과 MITF 단백질 발현을 증가시켰고, MITF mRNA 발현도 증가시켰다. cAMP 경로는 ERK의 활성을 유도하고, 활성화된 ERK는 CREB의 인산화와 MITF의 분해에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 연구에서 scopoletin이 ERK의 활성을 유도하는 것으로 확인되었지만, 이러한 작용이 CREB의 활성과는 관련이 없음을 증명하였다. 반면에 p38 MAPK는 scopoletin에 의하여 활성화되었다. 이상의 결과로 볼 때 scopoletin은 cAMP경로와 p38 MAPK경로를 통해 멜라닌 합성을 자극할 것으로 예상된다. 따라서 PKA 억제제인 H89와 KT5720, PKC 억제제인 RO-32-0432, p38 억제제인 SB203580을 사용하여 scopoletin에 의한 멜라닌 합성 증가와 tyrosinase 단백질 발현 증가가 차단되는지 확인하였다. H89, KT5720, 그리고 SB203580은 scopoletin으로 자극된 멜라닌 합성과 tyrosinase 단백질 발현을 현저하게 감소시켰다. 또한 H89 전처리 후 scopoletin에 의한 CREB인산화를 확인한 결과 인산화가 차단되었음을 확인하였다. Scopoletin이 세포 내의 cAMP 양의 변화에 영향을 미치는지 알아보기 위하여 radioimmunoassay를 실시하였다. Scopoletin은 cAMP 양을 유의성 있게 증가시켰다.
이상의 결과를 종합하면 scopoletin은 tyrosinase 활성과 멜라닌 합성을 증가시키고, 이러한 결과는 cAMP/PKA 경로와 p38 MAPK 경로를 통하여 MITF 발현을 증가시킴으로써 나타나는 결과임을 증명하였다. 따라서 scopoletin은 멜라닌 색소 합성 이상으로 인한 질환을 개선할 수 있는 치료 물질로서 가치가 있을 것으로 생각된다.

CHAPTER Ⅱ. In vitro와 in vivo에서 광 노화 개선에 scopoletin이 미치는 영향

노화란 나이가 들어감에 따라 신체적, 정신적 기능이 쇠퇴하는 것으로서 주름살 증가, 탄력성 감소, 피부 처짐 등의 현상이 나타난다. 피부 노화는 내인성 인자에 의한 자연노화와 외인성 인자에 의한 노화로 구분된다. 외인성 노화의 원인 중 하나인 자외선은 피부의 구조와 기능에 부정적인 영향을 주는 주요 환경적 인자이다. UV에 노출된 피부는 ROS를 생성하고, ROS는 세포의 기능과 항상성을 파괴함으로써 암 발생, 자가면역질환, 염증 발생 등의 다양한 질환을 야기시킨다. 이러한 ROS는 섬유아세포의 세포질 신호 전달을 교란시키는데, 이러한 신호 전달 경로는 최종적으로 세포 전사 인자인 AP-1을 활성화 시키게 된다. AP-1에 의해 조절되는 여러 가지 유전자들 중에는 MMPs와 type Ⅰ procollagen등이 있다. 이러한 유전자 발현의 변화는 세포 기질 파괴와 콜라겐 생성을 억제하여 광노화가 일어나게 한다.
본 연구에서는 배양된 human dermal fibroblast neonatal (HDFn)이 UVB에 노출되었을 때 MMP-1을 분비하는지 확인하였다. UVB에 노출된 HDFn은 MMP-1 분비량을 증가시켰다. 이렇게 증가된 MMP-1은 collagen분비를 촉진하여 피부 노화를 가속화시킨다. 따라서 MMP-1의 분비 및 활성을 억제할 수 있는 물질을 찾고자 다양한 천연물 유래 물질을 조사하였고, 그 중 scopoletin이 MMP-1의 분비 및 활성을 효과적으로 억제함을 발견하였다. 또한 scopoletin은 UVB 조사로 인한 procollagen의 감소를 대조군 수준으로 회복시킴을 확인하였다.
이상의 결과를 바탕으로 scopoletin이 무모 생쥐(hairless mice)에서 UVB 조사로 인한 광노화를 개선하는지 조사하였다. UVB가 조사된 무모 생쥐의 등쪽 피부에서 수분 함량은 대조군 보다 현저하게 감소였지만 scopoletin을 도포한 군에서는 수분 함량이 효과적으로 회복되었고, 경구 투여한 군에서도 회복되는 경향을 보였다. UVB는 무모 생쥐 표피의 두께를 현저하게 증가시켰지만 scopoletin을 도포하거나 경구 투여한 군에서는 표피 두께를 유의성 있게 감소시켰다. UVB가 조사된 무모 생쥐의 피부에서 MMP-3, -9, -13의 발현과 procollagen의 발현을 Western blot과 면역조직염색법으로 확인한 결과 MMP-3, -9, -13은 대조군 보다 현저하게 증가되어 있었고, procollagen은 감소되어 있음을 확인하였다. 그러나 scopoletin을 도포하거나 경구 투여한 무모 생쥐 피부에서는 MMP-3, -9, -13의 발현이 현저하게 억제되었고, procollage의 발현 또한 효과적으로 회복되었다. NFκB는 MMPs를 증가시키는 것으로 알려져 있고, 세포질에서 IκB와 결합된 불활성화 상태로 존재한다. IκB가 인산화되면 proteasome에 의해 분해되고 NFκB는 핵으로 이동하여 MMPs 생성을 조절한다. 본 연구에서는 scopoletin이 무모 생쥐의 피부에서 IκB 발현에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다. UVB가 조사된 군에서는 대조군 보다 IκB의 발현이 억제되었고, scopoletin을 도포하거나 경구 투여한 군에서는 현저하게 증가되었다. 이러한 scopoletin은 DPPH radical 소거 효능 또한 있는 것으로 조사되었다.
이상의 결과를 요약하면 scopoletin은 HDFn에서 UVB로 야기된 MMP-1의 발현을 억제하고, UVB로 감소된 procollagen을 효과적으로 회복시켰다. 또한 무모 생쥐에 scopletin을 도포하거나 경구 투여한 경우 UVB로 인한 MMPs 발현 증가를 억제하였고, 감소된 procollagen을 회복시켰다. 또한 UVB 조사로 감소된 IκB의 발현을 증가시켰다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Melanogenesis is a physiological process that results in the synthesis of melanin pigments, which play crucial protective role against skin photocarcinogenesis. In order to determine the effects of scopoletin on melanogenesis and elucidate the molecular events of melanogenesis induced by scopoletin, several experiments were performed in B16 melanoma cells. In this study, scopoletin was shown to stimulate melanin synthesis and tyrosinase activity in a concentration-dependent manner. Scopoletin induced the expression of tyrosinase, TRP-1 and microphthalmia-associated transcription factor (MITF) proteins. Moreover, it increased the phosphorylation ERK, cAMP response element binding protein (CREB) and p38 MAPK. In addition, scopoletin-induced melanogenesis was reduced by H-89, KT5720, protein kinase A (PKA) inhibitors, or SB203580, a p38 MAPK inhibitor, but not by Ro-32-0432, a PKC inhibitor, which suggests the involvement of PKA and p38 MAPK in scopoletin induced melanogenesis. Additionally, scopoletin induced the activation of cAMP response element (CRE), which suggests that scopoletin-induced melanogenesis is mediated by PKA, which occurs downstream of scopoletin-increased cAMP production. This result was further confirmed by the fact that scopoletin-induced phosphorylation of CREB was inhibited by H-89, but not by PD98059, a MEK1 inhibitor. Scopoletin-induced expression of tyrosinase protein was attenuated by H-89, KT5720 and SB203580. These results demonstrate that scopoletin induces melanogenesis through cAMP and p38 MAPK signaling pathway.

Chronic exposure to ultraviolet (UV) irradiation over the course of one’s lifetime produces changes in skin connective tissues by degradation of collagen, which is a major structural component in the extracellular matrix most likely mediated by matrix metalloproteinases (MMP), collagenases. These interactions result in dry, sallow-colored, leathery, furrowed skin. It was found that pre-treatment of human dermal fibroblast neonatal (HDFn) cells with scopoletin inhibit TNF-α-induced MMP-1 secretion and activity. Therefore, it investigated whether scopoletin inhibited expression of MMP-13, -3, -9, and destruction collagen in UVB irradiated hairless mice skin. By immunohistochemical analysis and Western blotting, it was confirmed that topical application and oral administration of scopoletin reduced UV-induced epidermal thickening and inhibited procollagen decrease induced by UVB radiation. Furthermore, scopoletin significantly prevented the UVB-induced expressions of MMP-13, -3 and -9, whereas markedly increased the UVB-reduced expression of IκBα. UVB-induced oxidative stress lead to damage that may result in premature skin aging. In this study, SC possessed the ability to scavenge DPPH radical to varying degrees in a dose-dependent manner. In addition, it was also found that decreased water content by UVB radiation was significantly retrieved with topical application and oral administration of scopoletin. These results demonstrate that topical application and oral administration of scopoletin can retrieve UVB-induced decrease in procollagen by inhibiting the MMPs, and water content of stratum corneum. Therefore, scopoletin is a potential agent for the prevention and treatment of UV-induced skin photoaging.

목차 (Table of Contents)

• CHAPTER Ⅰ. Effect of Scopoletin on Melanogenesis through cyclic AMP Signaling Pathway 1
• ABSTRACT 2
• 1. INTRODUCTION 4
• 2. MATERIALS and METHODS 7
• 2.1. MATERIALS 7
• 2.2. CELL CULTURES 7
• 2.3. MTT ASSAY 7
• 2.4. MEASUREMENT OF MELANIN CONTENT 8
• 2.5. MEASUREMENT OF TYROSINASE ACTIVITY 8
• 2.6. L-DOPA STAIN 9
• 2.7. IMMUNOFLUORESCENCE MICROSCOPY 9
• 2.8. WESTERN BLOT ANALYSIS 10
• 2.9. REVERSE TRANSCRIPTION-POLYMERASE CHAIN REACTION (RT-PCR) 11
• 2.10. RADIOIMMUNOASSAY OF CYCLIC AMP 11
• 2.11. STATISTICAL ANALYSIS 12
• 3. RESULTS 13
• 3.1. SCOPOLETIN INCREASES MELANIN SYNTHESIS IN B16 MELANOMA CELLS 13
• 3.2. SCOPOLETIN INCREASES TYROSINASE ACTIVITY IN B16 MELANOMA CELLS 13
• 3.3. CELL VIABILITY 14
• 3.4. EFFECT OF SC ON MELANOGENIC PROTEIN LEVELS 14
• 3.5. EFFECT OF SC ON INTRACELLULAR TYROSINASE LEVEL AND LOCATION 15
• 3.6. EFFECTS OF SC ON MELANOGENIC MRNA LEVELS 15
• 3.7. EFFECT OF SC ON MITF PRODUCTION 16
• 3.8. EFFECT OF SC ON PHOSPHORYLATION OF ERK AND P38 MAPK 16
• 3.9. SCOPOLETIN-INDUCED MELANIN CONTENT AND TYROSINASE ACTIVITY WERE INHIBITED BY PROTEIN KINASE A (PKA) AND P38 MAPK INHIBITORS 17
• 3.10. SCOPOLETIN-INDUCED TYROSINASE PROTEIN WAS INHIBITED BY PKA AND P38 MAPK INHIBITORS 18
• 3.11. SCOPOLETIN-INDUCED MELANOGENESIS THROUGH CAMP SIGNALING 18
• 3.12. EFFECT OF PD98059 AND H89 ON SC-INDUCED ERK AND CREB ACTIVATION 19
• 4. DISCUSSION 42
• REFERENCES 47
• CHAPTER Ⅱ. Effect of Scopoletin on Photoaging Improvement in vitro and in vivo 55
• ABSTRACT 56
• 1. Introduction 58
• 2. Materials and methods 61
• 2.1 CELL CULTURES AND UVB IRRADIATION 61
• 2.2. TRICHLOROACETIC ACID (TCA) CONCENTRATION AND WESTERN BLOT 61
• 2.3. REVERSE TRANSCRIPTASE (RT)-PCR 62
• 2.4. ELISA ANALYSIS 63
• 2.5. ANIMALS 63
• 2.6. UV IRRADIATION 63
• 2.7. MEASUREMENT OF SKIN MOISTURE CAPACITY. 64
• 2.8. IMMUNOHISTOCHEMISTRY 64
• 2.9. DPPH 65
• 2.10. STATISTICAL ANALYSIS 65
• 3. RESULTS 67
• 3.1. EFFECT OF SC ON UVB-INDUCED MMP-1 AND PRO-COLLAGEN TYPE 1 EXPRESSION IN HDFN 67
• 3.2. EFFECT OF SC ON CELL VIABILITY OF HDFN 68
• 3.3. EFFECTS OF SC ON TNF-Α-INDUCED ACTIVITY AND SECRETION OF MMP-1 IN HDFN 68
• 3.4. EFFECT OF SC ON BODY WEIGHT OF HAIRLESS MICE 68
• 3.5. EFFECT OF SC ON PLASMA BIOMARKER OF HAIRLESS MICE 69
• 3.6. EFFECT OF SC ON RATE OF INCREASES IN SKIN MOISTURE CAPACITY. 69
• 3.7. EFFECT OF SC ON UVB-INDUCED EPIDERMAL THICKNESS 70
• 3.8. EFFECT OF SC ON UVB-REDUCED PROCOLLAGEN TYPE 1 IN HAIRLESS MICE SKIN 70
• 3.9. EFFECT OF SC ON UVB-INDUCED MMPS IN HAIRLESS MICE SKIN 71
• 3.10. EFFECT OF SC ON UVB-INDUCED DEGRADATION OF IΚBΑ 71
• 3.11. EFFECT OF SC ON ANTIOXIDANT 72
• 4. Discussion 90
• REFERENCE 96
• Acknowledgments 105