The Role of Neogenin in the Mouse Spermatogenesis = 마우스 정자형성과정에서의 Neogenin의 역할
저자
발행사항
포천 : 차의과학대학교 대학원, 2019
학위논문사항
학위논문(석사)-- 차의과학대학교 대학원 : 의생명과학과 2019. 2
발행연도
2019
작성언어
영어
주제어
발행국(도시)
경기도
형태사항
; 26 cm
일반주기명
지도교수: 이재호
UCI식별코드
I804:41065-200000197099
소장기관
Spermatogonial germ cell differentiation is essential initial step for the spermatogenesis. Spermatogonia are male gamete germ cell and they have two tracks processing like proliferation and differentiation due to spermatogenesis. This proliferation and differentiation of germ cell tightly regulated by several factors depend on the microcellular environment. However, male germ cell regulation mechanism is still no clearly identified which factors determine for proliferation or differentiation. Neogenin was reported that abundantly expression in the testis (Wilson NH, 2007). However, the role of neogenin in the spermatogenesis is completely unknown. Here we want to investigate that the role of neogenin in the testis by knockdown of neogenin used by Crisper/CAS9 techniques.
First, we performed an immune histological study for the localization of neogenin in the testicular cell. Then neogenin expression profile analysis with postnatal 6days, 12days, 18days, 24days and old testis by western blot and Transcription-Polymerase Chain Reaction(RT-PCR). Second, we generated a neogenin knockdown mouse using by Crisper/CAS9 with neogenin repression gRNA. We performed direct injection in vivo transfection of neogenin gRNA + Crisper/CAS9 and transfection agent mixture for loss functional study. Then we analyzed the histological and molecular level of neogenin knockdown testis.
Results, Neogenin shows specific location at the spermatogonial and spermatocyte cell in seminiferous tubule of a testis. Base on the western blot analysis shows an age-dependently increase in protein expression of Neogenin until postnatal 24days. In the Neogenin knockdown mouse animals, we observed a significant decrease in spermatogonia differentiation compares with control testis. The neogenin knockdown testis show not to produce mature spermatids but showed no problems with proliferation suggesting neogenin promotes either meiosis or differentiation. The number of haploid cells in neogenin knockdown was greatly reduced because, without neogenin, cells cannot continue on to differentiation. The role of neogenin appears to be a signal receptor promoting meiosis or differentiation, and without this signal, cells will go through apoptosis.
These study results suggest that neogenin may play an important role in initial spermatogonia differentiation. And neogenin plays a vital role in spermatogenesis acting as a receptor for an important signal in spermatogenesis. In the case, spermatogonial arrest male infertility patient maybe apply to fixation of neogenin issue by Crisper/CAS9 technology.
정조세포는 정자형성과정의 초기단계에서 분열과 분화를 반복하여 남성 생식력을 결정짓는 웅성 생식 세포의 공급을 담당하는 세포이다. 정조세포의 분열과 분화를 조절하는 요인을 spermatogenesis factor라고 하며 이 요인은 정자형성과정에 관여하여 완전한 정자를 만들기 위해 서로 상호작용하고 있다. 그러나 정자형성과정은 복잡한 과정임과 동시에 수많은 spermatogenesis factor가 연관되어있어 아직까지도 그 기전이 명확히 맑혀지지 않았다. Neogenin은 신경, 근육, 골격 등과 같은 기관형성에 있어서 가이드라인의 역할을 해주는 물질임과 동시에 다양한 조직에서 발현되는 다기능 수용체로 알려져 있다. 그리고 특히 정소와 난소 같은 생식기관에서 다량으로 검출되는 것으로 알려져 있다. 현재까지는 Neogenin이 생식기관에서 담당하는 기능에 대한 부분은 보고된바 없기 때문에 본 실험에서는 마우스의 정소 내에서 Neogenin이 담당하는 기능에 대한 연구를 진행하고자 하였고 유전자 가위라 불리는 Crisper/CAS9을 이용하여 Neogenin 유전자를 knock down하는 기술을 적용하였다.
실험은 조직학적 분석을 통해 마우스 정소조직 내부에서 Neogenin이 존재하는 위치를 확인하고 웨스턴 블롯과 RT-PCR을 통해 6일령, 12일령, 18일령, 24일령, 고령 마우스의 정소 조직에서의 Neogenin의 발현 정도를 비교하였다. 그리고 기능적 분석 실험에서는 Crisper/CAS9과 transfection agent mixture, Neogenin을 타겟팅하는 gRNA를 조합하여 마우스 정소에 주사하였고 이렇게 제작한 Neogenin knock down 마우스 모델을 대상으로 대조군과 조직학적 수준에서, 분자 수준에서 비교 분석을 진행하였다.
그 결과, Neogenin은 세정관 내 존재하는 정조세포와 정모세포에서 특이적으로 발현되는 것을 확인하였고 정소를 이용한 웨스턴 블롯에서는 마우스가 성성숙에 도달하는 24일령까지 정소 내 Neogenin 단백질의 발현이 나이에 따라 증가하는 양상을 보였다. Neogenin이 knockdown된 마우스의 정소에서는 성숙된 정자가 검출되지 않았고 정조세포는 관찰되었으나 정모세포가 상당수 결실된 것을 확인할 수 있었다. 이러한 현상은 정모세포에서 apoptosis가 유발되어 발생한 것임을 실험을 통해 확인하였다. 즉 Neogenin은 정조세포가 정모세포 그리고 정자로 분화함에 있어 중요한 영향을 담당하는 것을 알 수 있었다.
본 실험의 결론은 마우스 정소 내 정조세포의 조기 분화단계에 있어서 Neogenin이 중요한 역할을 담당하고 있고 정상적인 정자를 생성하는 단계에서 중요한 수용체로서의 기능을 하고 있었다. 따라서 본 실험에 사용한 Crisper/CAS9 기술을 이용하여 Neogenin의 기능을 회복, 상승시킬 수 있다면 정자 성숙 장애로부터 발생하는 남성 난임 치료에 기여할 수 있을 것으로 생각된다.
핵심되는 말 : 정자형성과정, Neogenin, Crisper/CAS9
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