Rhodococcus sp. BH4 유래 α/β hydrolase type의 AHL-lactonase (JydB) 특성화 및 jydB 유전자 결손돌연변이주에 관한 연구 = Characterization of α/β hydrolase type AHL-Lactonase of Rhodococcus sp. BH4 and its mutant
저자
발행사항
대전 : 배재대학교 일반대학원, 2020
학위논문사항
학위논문(석사)-- 배재대학교 일반대학원 : 생명유전공학과 생명유전공학 2020. 2
발행연도
2020
작성언어
한국어
주제어
발행국(도시)
대전
형태사항
26 cm
일반주기명
지도교수: 이정기
UCI식별코드
I804:25007-200000288255
소장기관
Quorum sensing(QS)은 세균이 특정한 화학적 언어를 이용하여 세포 간 신호를 주고받는 독특한 커뮤니케이션(cell-to-cell communication) 시스템이다. 일부 세균은 자신이 세포외로 분비하는 신호분자인 N-acyl homoserine lactones(AHLs)의 세포 외 농도를 감지하여 농도에 비례하는 주변 세포밀도를 인식한다. 특히 많은 병원성 세균에서 AHL 신호분자를 매개로 하는 QS 시스템에 의해 병독성 관련 유전자들의 발현이 조절된다. 따라서 병독성을 억제하고자QS 시스템 차단하는 전략을 quorum quenching (QQ) 이라고 한다. 본 연구에서는 충청북도 옥천 하수처리장 분리한 QQ 균주인 Rhodococcus sp. BH4의 whole genome 분석 결과를 이용하여 in silico 분석을 통해 기존에 알려진 phosphotriesterase (PTE) family type의 AHL-Lactonase인 QsdA 단백질 이외에 추가적인 QQ 효소를 암호하고 있는 유전자를 규명하여 jydB (No. 1288)로 명명하였다. jydB 유전자가 암호화 하고 있는 QQ 효소를 특성화하기 위해 대장균에서 재조합 단백질을 고발현을 하여 Ni-NTA column을 이용하여 정제하였다. 기질인 AHL에 대한 재조합 단백질 JydB의 분해 기작을 규명하기 위하여 기질과 반응 후 분해 산물에 산을 첨가하여 AHL 복구 실험 및 분해 산물의 HPLC 분석을 통해 jydB 유전자가 암호화하는 효소는 AHL-lactonase 임을 확인하였다. 재조합 AHL-lactonase JydB와 HHL, OHHL 및 OHL의 반응을 통하여 모든 기질이 분해됨을 확인하였다. 또한 재조합 단백질 JydB 효소반응 속도론 분석을 통하여 특히 BHL과 OHHL에 활성이 우수한 것을 확인하였다. 재조합 AHL-lactonase JydB의 효소적 특성분석을 통해 JydB는 40℃까지 열안정성을 가지며, Co-factor로서 Cu2+가 필요함을 확인하였고, 생물막 형성 억제능도 우수하였다. 새로 발굴한 jydB 유전자에 의한 단백질의 추정 아미노산 서열은 기존에 알려진 AidH와 46%의 상동성을 보였으며, Aii810 , AiiM , QqlB , QqlG 및 QqlM과 각각 28%, 31%, 44%, 47%, 47%의 상동성을 보였다. JydB의 아미노산 서열 및 추정 활성부위 분석 결과 α/β hydrolase superfamily의 AHL-lactonase 와 많은 특징을 공유하는 것을 확인하였다. 결과적으로 Rhodococcus sp. BH4는 서로 다른 두 가지 type의 AHL-lactonase를 동시에 가지고 있음을 확인하였으며 두 가지 AHL-lactonase 유전자들의 결손돌연변이주 구축을 통해 두 유전자에 QQ활성에 미치는 영향을 조사하였다.
더보기Quorum sensing (QS) is a cell-to-cell communication system between bacteria, which regulates gene expression using specific signaling molecules. Some bacteria detect extracellular concentrations of N-acylhomoserine lactones (AHLs) to recognize population density. In many pathogenic bacteria, genes associated with virulence are controlled by the AHL-mediated QS system. Therefore, the quorum quenching (QQ) strategy for inhibition of QS system has attracted a lot of attention. Our lab isolated Rhodococcus sp. BH4 from Okcheon Sewage Treatment Plant and it was selected as representative QQ strain. In silico analysis of BH4 genome revealed the presence of a second AHL- lactonase (named JydB), in addition to previously reported QsdA which belongs to phosphotriesterase (PTE) family. In this study, the recombinant JydB was overexpressed in E. coli and analyzed for its biochemical properties. The amino acid sequence comparison of JydB and other known AHL-lactonases showed 46% homology with AidH and varying degrees of sequence similarity with Aii810, AiiM, QqlB, QqlG and QqlM (ranging from 28 to 47%). Active site analysis of predicted amino acid sequence of JydB indicated that it shares many characteristics of AHL-lactonases belonging to α/β hydrolase superfamily. AHL restoration and HPLC analyses were carried out to confirm the degradation mechanism of JydB and prove that it is an AHL-lactonase. Purified recombinant JydB exhibited high degrading ability of AHLs of varying lengths, however a preference towards BHL and OHHL was observed during the enzyme kinetics experiments. Furthermore, recombinant JydB showed thermal stability up to 40°C, and it’s hydrolytic activity against AHLs increased in the presence of Cu2+. Inhibition of biofilm formation was also observed against Aeromonas sp. Additionally, knockout mutants of the two AHL-lactonase genes were constructed in order to characterize their properties and assess the effects of these enzymes on the overall QQ capacity of Rhodococcus sp. BH4.
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