Pharmacokinetic study of GNE140, a lactate dehydrogenase A inhibitor, in rat and mouse using HPLC-MS/MS

국문 초록 (Abstract)

GNE140은 lactate dehydrogenase A (LDH-A)를 억제하여 암세포의 성장을 억제하는 항암 후보물질이다. 본 연구에서는 흰 쥐와 마우스 혈장 중 GNE140의 HPLC-MS/MS 분석법을 개발하고 약동학 연구에 성공적으로 적용시켰다. GNE140의 정량을 위한 분석기기는 애질런트사의 고성능 액체 크로마토크래피 1100 series와 질량분석기 API4000 Qtrap이 사용되었다. 이동상은 0.1% formic acid 가 첨가된 DW와 ACN을 50:50 비율로 구성하였고, C18컬럼과 C18 가드 컬럼의 조합으로 시료를 분리하였다. GNE140 및 내부 표준물질 Carbamazepine은 ESI positive MRM 모드로 각각 m/z 499.07 → 482.00, 237.20 → 194.20에서 분석되었고, 각각 2.44, 1.34분의 피크유지시간을 보였으며 다른 내인성물질의 간섭 없이 명확한 크로마토그램이 확인되었다. 시료 전처리는 단백질 침전법으로 진행되었고, GNE140은 2 ~ 3,000 ng/mL에서 양호한 직선성을 나타내었다. 흰 쥐와 마우스의 혈장에서 일내, 일간 정밀성(%CV) 및 정확성(%RE)은 모두 12% 미만이었고, 실온에서 6시간, 3번의 냉∙해동, 분석기기에서 24시간, 그리고 -20℃에서 4주까지 안정하였다. 생체시료의 영향, 회수율, 전처리법의 효율성 또한 83.39% - 101.3%로 입증되었다. FDA 가이던스 모든 항목의 기준을 충족하였고, 개발된 분석법은 신뢰할 수 있는 방법임을 시사하였다.
In vitro 연구로는 흰 쥐, 마우스, 인간의 혈장내 안정성과 흰 쥐, 마우스, 개, 인간의 간 마이크로솜에서의 안정성이 평가되었다. 각각 240분, 60분까지 매우 안정하여 GNE140의 소실 양상을 관찰할 수 없었고, 농도별로 진행된 마이크로솜 안정성 시험에서도 반감기가 일정한 구간을 구할 수 없었다. 결과적으로 GNE140의 주요 제거 경로는 1상 대사가 아닌 2상 대사 및 기타 경로로 예측할 수 있다. 추가로 약물-약물 상호작용을 확인하기 위한 지표로서 CYP450 효소 억제 실험과 혈장 단백 결합실험이 진행되었다. GNE140은 1A2, 2C9, 2C19, 2D6, 3A4 모두를 저해하지 않았으며, 흰 쥐, 마우스, 인간의 혈장에서 모두 99% 이상의 높은 혈장 단백 결합률이 확인되었다.
In vivo 연구로는 웅성 7주령 흰 쥐에서 1, 3, 10 mg/kg의 정맥 및 경구투여 시험과 웅성 6주령 마우스에서 3 mg/kg의 정맥 및 경구투여 시험이 수행되었다. 흰 쥐의 정맥 투여용량 범위 1 – 10 mg/kg에서 용량이 증가함에 따라 클리어런스와 분포용적이 감소하는 전형적인 비선형 패턴을 보였다. GNE140은 용량 의존적 약동학 특성을 가진 약물로 판단되고, 대사포화 때문인 것으로 예측할 수 있다. 흰 쥐와 마우스에서 경구 투여 후 생체 이용률은 각각 27.62% - 54.15%, 67.01%로 설치류 기준 보통 및 높은 수준으로 평가된다. 추가적으로 배설 시험에서GNE140 모약물이 소변과 대변으로 배설되는 양은 1% 미만으로 매우 적었다.
결론적으로, GNE140의 정량화를 위한 신뢰할 수 있는 HPLC-MS/MS 분석법이 개발되고 검증되었고, 성공적으로 약동학 연구에 적용되었다. 본 연구를 통하여 GNE140의 약동학적 특성을 규명하고, GNE140의 가능성을 확인하였다. 본 연구의 결과는 GNE140의 개발에 유용한 정보가 될 것이며, 나아가 LDH-A연구를 위한 참고자료로서 도움이 될 것으로 기대된다.

목차 (Table of Contents)

• I. Introduction 15
• II. Material and Methods 19
• 1. Chemicals and Solvents 19
• 2. Equipment 19
• 1) Equipment for collection of biological samples 19
• 2) Equipment for preparation of biological samples 20
• 3) Instrument for analysis 20
• 4) Animals 20
• 3. Analytical procedures of GNE140 in biological samples 23
• 1) Stock solution 23
• 2) Plasma sample preparation 23
• 3) Urine and fecal sample preparation 23
• 4) HPLC-MS/MS analysis condition 24
• 4. Analytical method validation 30
• 1) Specificity 30
• 2) Sensitivity 30
• 3) Linearity 30
• 4) Accuracy and precision 30
• 5) Stability 31
• 6) Matrix effect, recovery, and process efficiency 31
• 7) Dilution integrity 32
• 5. Pharmacokinetic study 33
• 1) In vitro study 33
• i. Plasma stability assay 33
• ii. Microsomal stability assay 34
• iii. Plasma protein binding assay .37
• iv. CYP inhibition assay 39
• 2) In vivo study 42
• i. Pharmacokinetic study in rat .42
• ii. Pharmacokinetic study in mouse 42
• iii. Excretion study of GNE140 43
• 3) Pharmacokinetic parameters analysis 44
• 4) Statistical analysis 45
• III. Results 46
• 1. Analytical method validation 46
• 1) Specificity 46
• 2) Sensitivity 46
• 3) Linearity 46
• 4) Accuracy and precision 51
• 5) Stability 51
• 6) Matrix effect, recovery, and process efficiency 51
• 7) Dilution integrity 51
• 2. Pharmacokinetic study 56
• 1) In vitro study 56
• i. Plasma stability assay 56
• ii. Microsomal stability assay 57
• iii. Plasma protein binding assay 60
• iv. CYP inhibition assay 62
• 2) In vivo study 66
• i. Pharmacokinetic study in rat 66
• ii. Pharmacokinetic study in mouse 73
• iii. Excretion study of GNE140 77
• IV. Discussion and Conclusion 81
• V. References 88
• Abstract 93