The role of glyoxalase 1 in the development of human pluripotent stem cell-derived alveolar epithelial cells and alveolar organoid : 인간 전분화능줄기세포 유래 폐상피세포 및 폐포 오가노이드 발생과정에서 glyoxalase-1 유전자 기능 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Glyoxalase1 (GLO1) is known to play a role in regulating homeostasis and pathological development in various tissues. However, the role of GLO1 in early lung development and pulmonary diseases has not been well elucidated. In this study, the function of GLO1 in normal lung tissue and early alveolar development has been investigated using two GLO1 knockout (GLO1-/-) systems Glo1-/- mice as an in vivo model and GLO1-/- human pluripotent stem cells (hPSCs) for the generation of alveolar epithelial cells (AECs), and alveolar organoids (AOs) as an in vitro model. Gene trapping and CRISPR/Cas9 technologies have been used to generate Glo1-/- mice and GLO1-/- hPSCs, respectively. Hyperglycemic conditions are characterized by several factors such as oxidative stress, fibrosis, leuckocytes infiltration, morphological alterations, reduction of GLO1 expression, and activity. Streptozotocin-induced diabetic lung tissues of mice showed a reduction in expression, and activity of GLO1, which suggested the potential role of GLO1 in maintaining the normal function of the lung tissues. Knockout of GLO1 can partially mimic the molecular and histological changes as shown in diabetic mice lung tissue. Moreover, GLO1 deficiency in hPSCs delayed AEC differentiation and led to the reduction of AO diameter and lower efficiency of anterior foregut spheroid formation. GLO1 also negatively regulates the expression of definitive endoderm (DE)-related genes during hPSC differentiation. Taken together, GLO1 could be a regulator for the development of respiratory diseases and early alveolar tissues. Furthermore, the underlying molecular mechanisms of how GLO1 mediates DE specification need to be explored.

국문 초록 (Abstract)

Glyoxalase 1 (GLO1)은 인체의 다양한 조직에서 발현하며, 항상성 유지와 병리학적 발생 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 초기 배아의 폐 발생 및 폐질환에서 GLO1의 시공간적 발현 양상 및 기능에 대해서는 연구가 미비하다. 본 연구에서는 초기 폐 발생과 폐 조직의 항상성 유지에 있어서 GLO1의 기능을 규명하기 위해 GLO1 결핍 (GLO1-/-) 인간 전분화능줄기세포와 생쥐 모델을 활용하였다. Streptozotocin 유발 당뇨 생쥐의 폐는 산화스트레스 및 섬유화 관련 유전자의 발현의 증가를 보였고, 폐포 내 대식세포 및 호중구세포와 같은 면역세포의 유입 (infiltration)과 함께 폐포 벽의 두께가 유의하게 증가함을 관찰할 수 있었다. 또한, Glo1의 발현 및 활성화 정도가 정상 생쥐 군과 비교하여 유의하게 감소함이 관찰되었다. 흥미롭게도 당뇨 유발 쥐에서 보여지는 폐 조직의 조직형태학적 및 생리학적 변화가 Glo1-/- 생쥐의 폐 조직에서도 유사하게 관찰되었다. 이 결과는 Glo1이 폐 조직의 항상성 유지에 중요한 조절인자임을 증명한다. 인간 폐 조직에서 GLO1의 기능을 검증하기 위해 GLO1-/- 인간 전분화능줄기세포 유래 폐 생체모사체 (Alveolar organoid, AO)를 제조하여 정상 대조군과 비교한 결과 AO 직경에서 유의한 감소와 더불어 산화스트레스 및 섬유화 관련 유전자의 증가를 관찰하였다. 또한, GLO1 결핍은 전분화능줄기세포의 초기 내배엽과 폐상피세포로의 분화를 지연시키는 효과를 보였다. 본 결과를 종합해보면, 초기 폐 발생과 폐 조직의 항상성을 유지하는데 GLO1의 발현이 매우 중요한 역할을 하고 있음을 시사하고 있다. 그러나, GLO1이 어떤 분자생리학적 조절 기전을 통해 폐 발생과 항상성 유지에 기여하는지는 불분명 하다. 따라서, 향후 이에 대한 심도 있는 후 연구가 필요할 것으로 사료된다.

목차 (Table of Contents)

• ABSTRACT Ⅰ
• ACKNOWLEDGMENT Ⅲ
• CONTENTS Ⅴ
• LIST OF FIGURES Ⅷ
• LIST OF TABLE Ⅸ
• LIST OF ABBREVIATIONS Ⅹ
• I. INTRODUCTION 1
• II. MATERIALS AND METHODS 4
• 1. Maintenance of hPSCs 4
• 2. AEC differentiation 4
• 3. Generation of AO 5
• 4. GLO1 Knockout plasmid design 6
• 5. CRISPR/Cas9-mediated genome editiong 6
• 6. Quantitative real time PCR (qPCR) 7
• 7. Flow cytometry 10
• 8. Mice 10
• 9. Streptozocin-induced diabetes 11
• 10. Generation of GLO1 knockout mice 11
• 11. Morphological analysis of the mouse lung tissue 11
• 12. Immunofluorescence staining 12
• 13. Western blot analysis 13
• III. RESULTS 14
• 1. Hyperglycemia-induced histophysiological alteration in mouse lung 14
• 2. Hyperglycemia-induced leukocytes infiltration and oxidative stress in lung tissue of mice 17
• 3. Glo1-/- mice partially mimics hyperglycemia-induced morphological alteration of lung tissue 19
• 4. Glo1-/- mice partially mimics hyperglycemia-induced leukocytes infiltration and oxidative stress in lung tissues 21
• 5. hPSC-derived AOs are multi-cellular resemble to in vivo counterpart - 23
• 6. GLO1-/- hPSCs-derived AOs mimic hyperglycemia-induced lung alterations 25
• 7. GLO1-/- hPSCs impair AEC differentiation and AOs development 28
• 8. GLO1-/- hPSCs impair AF spheroid formation and development 30
• 9. GLO1-/- hPSCs impair DE specification at the transcriptional level 33
• 10. GLO1-/- hPSCs impair DE specification at the translational level 36
• IV. DISCUSSION 39
• V. CONCLUSION 44
• Ⅵ. REFERENCES 45
• Ⅶ. ABSTRACT IN KOREAN 53