사상자의 Coumarin을 이용한 동시분석법 개발

국문 초록 (Abstract)

KHP에 수재된 두 가지 기원의 사상자 중 벌사상자 C. monnieiri를 methanol 추출하여, 용매의 극성에 따라 hexane, ethyl acetate, butanol, Water로 분획하여, 이 중 coumarin성분을 다량 함유하고 있는 hexane 분획에 대하여 성분분리를 실시하였다.
silica gel을 이용한 column chromatography를 통해 총 4개의 화합물을 얻어 물리화학적 성상과 문헌조사, 각종 기기분석(1H-NMR, 13C-NMR, Mass, HSQC, HMBC)을 통하여 구조동정을 실시하였고 그 결과 Compound Ⅰ은 osthol (C15H16O3)로, Compound Ⅱ는 imperatorin(C16H14O4), Compound Ⅲ은 bergapten(C12H8O4), Compound Ⅳ는 5,7-dimethoxycoumarin (C11H10O4)으로 확인 동정 하였다.
HPLC/DAD와 HPLC/ELSD를 이용하여 Coumpound Ⅰ-Ⅳ 의 순도 실험 및 ICH 가이드라인을 기준으로 분석법 검증을 실시하여 분석법의 타당성을 검증하였다. HPLC 분석을 위하여 AKZO NOBEL Kromasil 100-5 C18 (250 × 4.6mm) column을 사용하였고 이동상으로는 물과 메탄올을 65 : 35비율에서 30분간 65 : 35 → 80 : 20 → 65 : 35 로 변화시켜 사용하였고, UV 254nm 파장에서 확인하였다.
HPLC/UV를 이용하여 국내 및 중국에서 유통되고 있는 사상자 15종에 대한 함량평가를 실시한 결과 전체 시료에서 osthol은 평균 3.45 ± 1.341%, imperatorin은 평균 1.311 ± 0.346 %, bergapten은 평균 0.03 ± 0.015%, 5,7-dimethoxycoumarin은 평균 0.1 ± 0.096 % 를 함유하고 있는 것을 확인할 수 있었다.
전체 시료에서 사상자에서 분리한 4개의 지표물질 중 osthol의 함량이 3% 이상으로 나타나, 가장 많은 함량을 나타낸 시료는 중국 하화지 약령시장에서 구입한 것으로 함량이 6% 이상이었다.
또한 다른 종의 품종이 혼용될 위험을 우려하여 동시분석을 통한 총함량 제안을 하기위해, HPLC/UV 함량평가 결과를 이용한 다변량분석 (PCA)을 통하여 성분별 유사성 실험을 실시하였으며 그 결과 사상자의 패턴은 모두 유사한 패턴을 나타냈으며, 중국 하화지 약령시장에서 구입한 1번, 2번 샘플과 중국 산서성의 11번 샘플이 다른 샘플들과는 조금 다른 패턴을 보였다. osthol의 함량이 샘플들 중에 가장 높게 나타는 1,2 번과 imperatorin의 함량이 극히 작은 11번의 함량 차이에 따라 다른 패턴을 보이는 것으로 확인 하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

In present study, a simultaneous analytical method for the quality determination of Cnidii Fructus using its coumarins was developed. By using various solvents, the fractions of hexane, ethyl acetate, butanol, and water were obtained from the methanol extract of Cnidii Fructus. 4 components were isolated from hexane fraction of Cnidii Fructus. by gel column chromatography using silica gel. The compounds were determined by such methods as 1H-NMR, 13C-NMR, FAB-Mass, HSQC, and HMBC spectrometry.The results demonstrated that Compound Ⅰ(C15H16O3) was osthol; Compound Ⅱ(C16H14O4) was imperatorin; Compound Ⅲ(C12H8O4)was bergapten; and Compound Ⅳ(C11H10O4) was 5,7-dimethoxycoumarin. CompoundⅠ-Ⅳ were decided as representative components of Cnidium monnieri. HPLC analytical method was established using representative components and 15 commercial samples, which were collected considering to various cultivated area.
The HPLC fingerprinting was successfully achieved with a AKZO NOBEL Kromasil 100-5C18 (250×4.6mm) column. The mobile phase consisted of water (A) and methanol (B) using gradient method of 35(A) to 65(A) for 30 min. The fingerprint of chromatograms was recorded at an optimized wavelength of 254nm. This developed analytical method was validated with specificity, selectivity, accuracy and precision.
In addition, principal component analysis (PCA) was performed on the analytical data of 15 different Cnidii Fructus samples in order to classify samples collected from different regions. As a result, contained quantity of osthol was measured 3.45 ± 1.341%, imperatorin was measured 1.311 ± 0.346 %, bergapten was measured 0.03 ± 0.015% and 5,7-dimethoxycoumarin was measured 0.1 ± 0.096 %.
Using isolated Compounds for measuring their contents is the meaning of suggesting distinctive components among Cnidii Fructus. We hope that this study contributes to supply of the standardization and quality control of herbal medicine.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 실 험 4
• 1. 실험 재료 4
• 2. 기기 및 시약 4
• 3. 실험 방법 6
• 3.1. 추출 및 분획 6
• 3.2. hexane분획으로부터 화합물의 분리 및 구조결정 8
• 3.2.1. Compound Ⅰ 8
• 3.2.2. Compound Ⅱ 10
• 3.2.3. Compound Ⅲ 11
• 3.2.4. Compound Ⅳ 12
• 3.3. 사상자의 지표성분을 통한 분석법 개발 및 모니터링 14
• 3.3.1. 사상자의 지표성분의 순도확인 14
• 3.3.2. HPLC를 이용한 사상자의 패턴분석 15
• 3.3.3. HPLC를 이용한 분석법 검증 17
• 1) 선택성(Specificity) 18
• 2) 직선성(Linearity) 18
• 3) 정량한계(LOQ) 18
• 4) 검출한계(LOD) 19
• 5) 정확성(Accuracy) 19
• 6) 정밀성(Precision) 19
• ① 반복성(Repeatability) 19
• ② 실험실내 정밀성(Intermediate precision) 19
• 3.3.4. HPLC를 이용한 사상자의 함량모니터링 20
• Ⅲ. 결과 및 고찰 21
• 1. 분획 및 화합물의 분리 21
• 2. 활성분획에서 분리된 물질의 확인 동정 22
• 2.1. Compound Ⅰ 22
• 2.2. Compound Ⅱ 23
• 2.3. Compound Ⅲ 24
• 2.4. Compound Ⅳ 25
• 3. 사상자의 지표성분을 통한 분석법 개발 및 모니터링 27
• 3.1 HPLC/DAD와 HPLC/ELSD를 이용한 지표성분의 순도확인 27
• 3.2. HPLC를 이용한 사상자의 패턴분석 37
• 3.3. HPLC를 이용한 분석법 검증 38
• 1) 선택성(Specificity) 38
• 2) 직선성(Linearity) 38
• 3) 검출한계(LOD) 39
• 4) 정량한계(LOQ) 39
• 5) 정확성(Accuracy) 41
• 6) 정밀성(Precision) 42
• 3.3. HPLC를 이용한 사상자의 함량모니터링 44
• 3.5. PCA를 이용한 함량 구분 46
• Ⅳ. 결 론 49
• Ⅴ. 참고문헌 51
• 국문초록 66
• Abstract 68