인체세포모델을 이용한 cisplatin의 발암성 평가 및 작용기전분석 = Carcinogenicity of Cisplatin and Its Mechanisms in Human Epithelial Cells in Culture

국문 초록 (Abstract)

Cisplatin은 단독 또는 병용으로 널리 사용되는 화학적 항암요법제로서 세포의 DNA 와 직접 작용하여 내전물질을 형성함으로서 암세포를 직접 작용하여 내전물질을 형성함으로서 암세포를 사멸시키는 작용을 가지고 있다. 그러나 cisplatin의 이러한 세포독성작용은 암세포에 대한 특이성을 가지고 있지 않아 정상적인 세포의 유전자 물질에서도 내전형성을 일으킨다. 따라서 cisplatin의 이러한 세포독성작용은 암세포에 대한 특이성을 가지고 있지 않아 정상적인 세포의 유전자 물질에서도 내전형성을 일으킨다. 따라서 cisplatin의 투여에 의한 이차적인 종양의 발생가능성은 상존해 있으며 실지로 최근보고에 의하면 cisplatin치료시 백혈병 등이 증가하는 것으로 나타나 잇다. 그러므로 본 연구는 인체상피세포를 이용하여 cisplatin의 발암성을 정량적으로 분석하여 용량-반응 관계를 규명함으로서 cisplatin에 의한 2차적인 종양발생의 가능성을 최소화 할수 있는 근거를 마련하고자 하였다. 또한 인체세포모델의 발암특성 획득 과정에서 일어나는 생물학적 현상을 분자생물학적 방법으로 분석함으로써 cisplatin의 발암기전 및 암발생을 예견할수 있는 생물학적 지표의 개발에 기여하고자 하였다.
1. 인체상피세포에서 cisplatin은 0.5ng/ml 이하에서는 발암세포의 특징을 나타내지 않은 반면 5ng/ml이상에서는 발암특성이 나타나 본 연구모델에서 cisplatin의 발암성은 반응역치(threshold)가 존재함을 보여 주었다.
2. cisplatin투여후 강력한 발암촉진물질인 TPA를 처리한 결과 cisplatin의 발암성은 더욱 증가하여 본 실험체제에서 cisplatin이 발암개시물로서 작용하였을 것으로 추정된다.
3. cisplatin투여후 steroid hormone인 hydrocorttisone을 처리한 결과 cisplatin의 발암성이 더욱 증가하였다. 이는 hydrocortisone의 암세포에 대한 선별적 성장 촉진에 기인하는 것으로서 steroid hormone과 cisplatin병용사용에 더 많은 연구의 필요성을 제시하였다.
4. Western blot결과 발암특성을 나타낸 세포에서 TGF-β3 및 fibronectin의 표현이 높게 나온것은 TGF-β3 fibronectin의 결합력 증가에 관련되어 있음을 보인 보고와 일치하는 결과로써 cisplatin의 발암과정에 TGF-β3 fibronectin의 관련성이 있음을 보이는 계기가 되었다.
5. 인체상피세포의 발암화에 밀접하게 관련되어 있는 protein kinase C의 isoform을 분석한 결과 발암성을 나타낸 세포군에서 α 및 γ형태에서 발현이 높게 나왔다. 따라서 cisplatin의 발암성에 PKC가 관련하고 있을 뿐 아니라 PKC의 isoform에 따른 반응의 차이가 있음을 증명함으로써 PKC isoform이 cisplatin의 발암에 관련되어 있음을 보였다.
본 연구는 cisplatin이 인체상피세포에서 종양을 일으킬 수 있음을 입증하여 cisplatin사용에 따른 제2의 종양발현 가능성을 입증하였고 정량적 분석을 통하여 발암성에 대한 용량-반응 관계를 확립하였다. 또한 TGF-β3, fibronectin, PKC 등이 cisplatin의 발암과정에 관여하고 있음을 보여 이들 세포분자물질이 생체지표로서 개발될수 있는 가치성을 보였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Human epithelial cell line immortalized by Ad12-SV40 hybrid virus was used to assess carcinogenic potentials of cisplatin in human cells.
When cells were exposed with cisplatin for 5 days and subsequently subcultured 8 times, cisplatin equal to or above 5 ng/ml showed increases of tumorigenic cellular properties such as saturation density, soft-agar colony formation, and cell aggregation. In contrast, cells treated with cisplatin below 5 ng/ml or control cells did not show significant increases of tumorigenic cellular properties. This observation indicates that there is a threshold effect in carcinogenicity of cisplatin in this human cell model.
Cells treated with cisplatin and subsequent exposure to a potent tumor promotor, TPA, showed significant increases of tumorigenic cellular properties and shortened appearance time of foci, as compared to those of control cells or cells treated with TPA only. Increases of tumorigenic properties by TPA treatment suggest that cisplatin be an effective tumor initatior in this cellular system.
Cisplatin-treated cells cultured with an elevated level of hydrocortisone (10 μg/ml) showed additional increases of tumorigenic properties, as compared to control cells or cells treated with cisplatin only, indicating a possible synergistic carcinogenic effects between cisplatin and steroid hormone.
Significant induction of TGF-β3 and fibronectin was observed in cisplatin-transformed cells, suggesting a possible association between these cellular molecules and cisplatininduced carcinogenesis. Expression of PKC isoforms was also increased in cisplatintransformed huma cells. This result represent a first demonstration that PKC isoforms may be associated with cisplatin-induced carcinogenesis in human cells. Further studies on the spatial distribution of these isoforms are required to clarify individual roles.
In summary, the present study demonstrates that carcinogenicity of cisplatin is dose-dependent and can be elevated by TPA or hydrocortisone in this human cell system. It is suggested that extracellular matrix, growth factor or PKC isoforms may play certain roles in cisplatin-induced carcinogenesis.