서양애기장대와 Yeast 내 Brassinosteroids의 생합성에 관한 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A large-scale analysis of Arabidopsis thaliana (30 Kg) revealed that doli-chosterone (DS), homodolichosterone (HDS) and 26-norcastasterone (26-norCS) as well as CS and brassinolide (BL) and 28-norCS which are already identified are contained in the plant. This suggests that multiple biosynthetic pathways to produce CS/BL, 28-norCS, DS and HDS, namely 24-methyl C28-BRs, 24-nor C27-BRs, 24-methylene C28-BRs and 24-ethylidene C29-BRs biosynthesis pathway are operating in the plant.

To establish possible biosynthetic pathways for BRs, an enzyme solution was prepared from A. thaliana, and metabolic study with biosynthetic in-termediates was carried out. The presence for a biosynthetic sequence for 24-nor C27-BRs, cholesterol (CHR), 22-hydroxyCHR, 22-hydroxy-cholesta-4-en-3one, 22-hydroxy-cholesta-3-one was demonstrated in A. thaliana. Coupled with the presence for downstream biosynthetic sequences for 24-nor C27-BRs, this strongly suggests that a new biosynthetic pathway for 24-nor C27-BRs, namely cholestanol-independent pathway, is functioned in the plant.

The Arabidopsis enzyme solution catalyzed the conversion of 6-deoxoDS to DS, demonstrating that 24-methylene BRs biosynthesis is operative in the plants. To identify the enzyme mediating the conversion of 6-deoxoDS to DS, enzyme solutions were prepared from cyp85a1, cyp85a2 and cyp85a1/a2 mutant, and the C-6 oxidation for 6-deoxoDS to DS was examined with the enzyme solution. In cyp85a1 mutant, the conversion rate was approximately 5% reduced compared to that in wild type. In cyp85a2, almost 90% reduced conversion rate was detected than that in wild type. In cyp85a1/a2 mutant, no conversion was shown. These indi-cate both CYP85A1 and CYP85A2 catalyze the C6-oxidation, and CYP85A2 is more powerful C6-oxidase than CYP85A1 in Arabidopsis.

The enzyme solution did not convert DS to dolicholide (DL) and HDS to homoDL. In addition, CYP85A2 which is also known as a BR 7-lactonase, did not catalyze both the 7-lactonations. Therefore, the end product for 24-methylene C28-BRs and 24-ethylidene C29-BRs biosynthesis is not DL and HDL but DS and HDS in Arabidopsis.

To establish biosynthetic connections, in vitro enzymatic conversions with end products for multiple biosynthesis in Arabidopsis were examined. When 28-norCS was used as a substrate, DS, CS and 26-norCS was de-tected as products. When DS was sued, CS was identified as a product. These provide that 24-nor C27-BRs biosynthesis is connected to 24-methyl C28-BRs biosynthesis via 24-methylene C28-BRs biosynthesis. When HDS was added as a substrate, DS was characterized as a product. Additionally, HCS was identified as a product. These results indicate that 24-ethylidene C29-BRs biosynthesis is connected to both 24-methylene C28-BRs and 24-ethyl C29-BRs biosynthesis. When HCS was used as a substrate, CS was detected as a product, suggesting that 24-ethyl C29-BRs biosynthesis is connected to 24-methyl C28-BRs biosynthesis. Altogether, multiple pathways for BRs is biosynthetically connected to maintain homeostatic concentration of a biologically active BR, CS in Arabidopsis.

It has been demonstrated that a yeast cell line, WAT21 produces CS. In the study, we determined the presence for a biosynthetic sequence, teas-tererone (TE), typhasterol (TY), CS in the yeast cells. Additionally, CS and TY were identified as metabolites for campesterol. These implicate that yeast, at least WAT21, is a useful microbial organism to produce BRs eco-nomically for the sue of BRs in agriculture.

국문 초록 (Abstract)

서양애기장대에서 대량의 시료를 통한 BRs 분석 결과 기존에 동정된 활성형 BR인 28-norCS, CS, BL, 이외에도 C28-BR 이면서 C24-methylene type의 BR인 DS, C29-BR 이면서 C24-ethylidene type의 BR인 HDS 등을 GC-Mass에 의하여 처음으로 동정하였고 특히 BRs의 불활성화 기작에 의하여 생성된다고 알려진 C27-BR인 26-norCS을 식물계에서는 처음으로 동정하였다.

동정된 DS, HDS, 26-norCS을 중심으로 생합성 경로를 파악해 본 결과, DS의 전구체인 6-deoxoDS이 DS으로 전환됨을 서양애기장대에서 추출한 효소원의 전환실험을 통하여 확인하였다. 이 과정에는 CYP85A1/A2라는 효소가 관여함을 cyp85a1, cyp85a2, cyp85a1/85a2 의 돌연변이 식물체에서 추출한 효소원의 대사 전환 실험으로 증명하였고 특히 CYP85A2가 주도적 역할을 한다는 것을 본 연구를 통하여 확인하여 C6-oxidation에 의하여 deoxoDS이 DS으로 전환 됨을 확인하였다. 또한 CYP85A2는 lacto-nase의 기능도 갖고 있음이 선행연구를 통하여 알려진 바 있어 CYP85A2가 DS과 HDS을 각 각 DL와 HDL로 전환시킬 수 있는 지를 확인하여 본 결과 상기와 같은 반응은 매개하지 않음을 알 수 있었다. 동정된 26-norCS은 CS이 demethylation에 의하여 생성되는 화합물이라 알려져 있어 서양애기장대 효소원에서 CS의 대사 산물을 분석하여 본 결과 26-norCS이 동정되었고 생리활성검사를 해 본 결과 26-norCS이 CS의 1/10 수준인 것이 확인되어 CS의 불활성화 기작과 해당 화합물의 동정이 모두 이루어진 의미 있는 결과라 사료된다. 이는 C-28 demethylation과는 상반된 결과로 BRs의 side chain demethylation은 탄소 위치에 따라 활성을 늘리거나 줄이는 중요한 반응으로 이 반응을 촉매 하는 demethylase의 동정은 활성형 BR의 항상성 조절 기작을 이해하는 데 매우 중요하다고 사료된다.

C27-BR의 최종산물인 28-norCS은 CHR이 CHN로 변환된 뒤 6-oxoCHN로 전환되는 CHN-dependent pathway에 의하여 합성됨이 알려져 있었으나, 생합성 경로상에 있는 28-norCT이 동정되지 않고, 대사 전환의 몇 몇 반응이 잘 일어나지 않음에 착안하여 새로운 생합성 경로가 있을 것이라는 예측 하에 순차적인 대사 전환 실험을 통하여 CHR이 22-OH-CHR, 22-OH-cholesta-4-en-3-one으로 생합성이 진행되는 이른바 CHN-independent pathway의 경로를 처음으로 확립하였다.

각 생합성 경로들 간의 연결성 여부를 파악해보기 위하여 먼저 C27-BRs와 C28-BRs의 생합성 경로간의 연결성을 연구하여 본 결과, 28-norCS이 CS으로 전환됨은 선행 연구를 통하여 C-24 methylation에 의한 과정으로 알려져 있었으나 정확한 화학반응의 mechanism이 밝혀져 있지 않았었는데, 28-norCS이 DS을 경유하고 DS이 DWARF1의 매개에 의한 reduction으로 CS을 생성함을 본 연구를 통하여 처음으로 확인하였다. C29-BRs와 C28-BRs의 생합성 연결을 조사해본 결과 C29-BR인 homoCS은 C28-demethylation에 의하여 C28-BR인 활성형 CS으로 전환됨을 확인하였고, 역시 C29-BR인 homoDS은 C28-demethylation에 의하여 DS로 전환된 후 상기 서술한 reduction에 의하여 CS으로 전환됨을 확인하였다. 상기의 결과를 종합해 볼 때 C27-BRs와 C28-BRs는 C24-methylation에 의하여 생합성적으로 연결되어 있으며 C29-BRs와 C28-BRs는 C28-demethylation에 의하여 생합성 연결되어 있음을 확인하였다. 즉 복수로 존재하는 BRs의 생합성 과정은 C24 위치에서의 methylation과 demethylation에 의하여 활성형 BR를 생합성하고 C26 위치에서의 demethylation에 의하여 불활성화되는 BRs의 side chain의 길이 조절이 활성형 BR, 즉 CS의 함량 조절에 중요한 기작으로 생각된다. 또한 각 생합성 경로들의 최종 산물들은 모두 24-methyl BR인 CS으로 연결되어 있음을 확인 하였는 데, 이는 활성형 BR인 CS이 생체 내 함량을 적정하게 유지하기 위한 별도의 생합성 경로들이 존재한다는 의미로 해석된다.

BRs를 산업계에서 활용하기 위해서는 적은 비용으로 BRs를 대량으로 생산 할 수 있는 system이 필요하다. 이러한 system을 개발하기 위해 yeast라는 hetero 생물개체에서의 BRs 생합성을 연구해본 결과, TE→3-DHT→TY→CS으로 이어지는 생합성 경로가 yeast에서도 존재함을 확인하였으며 BRs 최초의 생합성 전구 물질인 CR의 대사 산물로 TY, CS이 발견되어 sterol로부터 BRs 최종 산물이자 활성형 BR인 CS로의 합성이 가능함을 yeast에서 증명하여 BRs 대량생산의 학문적 기초를 확립하였다.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 종합서론 1
• Ⅰ. BRs의 연구 역사 3
• Ⅱ. BRs의 종류 5
• Ⅲ. BRs의 구조적 특징 9
• Ⅳ. BRs의 생합성 11
• Ⅴ. BRs의 생리활성 18
• Ⅵ. BRs의 신호전달 21
• Ⅶ. BRs의 산업적 이용 28
• Ⅷ. 연구목적 29
• 제2장 서양애기장대 내생 BRs의 동정 32
• Ⅰ. 서론 32
• Ⅱ. 재료 및 방법 34
• 1. 서양애기장대 시료 확보 34
• 2. BRs의 추출 35
• 3. BRs 분석 35
• 3-1. Bioassay 35
• 3-2. Bioassay결과의 측정 및 data정리 36
• 3-3. Chromatography 37
• 3-4. HPLC 40
• 3-5. GC-Mass 41
• Ⅲ. 결과 42
• 1. 각 분석 단계별 정제된 시료의 양 42
• 1-1. silica chromatography의 bioassay결과 43
• 1-2. LH20 chromatography의 bioassay결과 44
• 1-3. Sepak C18 chromatography의 bioassay결과 45
• 1-4. HPLC 46
• 2. GC-Mass 결과 52
• 2-3. 내생 Brassinolide의 동정 52
• 2-4. 내생 26, 28norCS의 동정 53
• 2-5. 내생 Dolicosterone의 동정 55
• 2-6. 내생 Castasterone(CS)의 동정 56
• 2-7. 내생 HDS의 동정 57
• Ⅳ. 고찰 58
• 제3장 서양애기장대 내의 새로운 생합성 경로에 관한 연구 63
• Ⅰ. 서론 63
• Ⅱ. 재료 및 방법 64
• 1. 대상식물의 생육 64
• 2. 효소원 조제 64
• 3. 단백질 정량 65
• 4. Substrate의 feeding 65
• 5. 효소반응 산물의 정제 - EtOAc에 의한 반응 산물의 추출 66
• 6. HPLC, TLC, GC-Mass 66
• 7. CYP85A1/A2 형질전환 Agrobacterium 제작 67
• 7-1. 85A1/A2 cDNA의 binary vector내로 도입 67
• 7-2. Transformation of 85A1/A2 vector construct into Agrobacte-rium 68
• 7-3. 85A1/A2 형질전환 식물체 제작 69
• 7-4. 85A1/A2 과발현 돌연변이체 선별 69
• Ⅲ. 결과 71
• 1. 새로운 C27-BRs의 생합성 경로 71
• 1-1. CHR에서 22-OH CHR로의 전환 72
• 1-2. 22-OH-CHR에서 22-OH-cholesta-4-en-3-one로의 전환 73
• 1-3. 22-OH-cholesta-4-en-3-one에서 6-deoxo-28-nor-3DHT로의 전환 74
• 2. 24-methylene BRs 생합성 경로 75
• 2-1. 6-deoxoDS에서 DS로의 효소 전환 76
• 2-2. DS C6-oxidase의 동정 77
• 3. DS에서 DL로의 변환 80
• 4. Ethylidene BRs 생합성 82
• 5. CS의 생분해 과정 84
• Ⅳ. 고찰 86
• 제4장 서양애기장대 내 BRs 생합성의 상호연결 97
• Ⅰ. 서론 97
• Ⅱ. 재료 및 방법 98
• 1. 대상식물의 생육 98
• 2. 효소원 조제 98
• 3. 단백질정량 99
• 4. Substrate의 feeding 100
• 5. 효소반응 산물의 정제 100
• 6. HPLC, GC-Mass 100
• 7. 애기장대 dwf1 mutant 제작 및 선별 101
• 7-1. 식물재료 101
• 7-2. 애기장대 종자심기 101
• 7-3. dwf1에서 homozygote 선별 101
• 7-4. Kanamycin resistance 조사 102
• 7-5. Genomic DNA 추출 102
• 7-6. Genomic DNA PCR 103
• Ⅲ. 결론 104
• 1. C27-BRs와 C28-BRs 생합성의 상호 연결 104
• 2. C28-BRs와 C29-BRs 생합성의 상호 연결 111
• Ⅳ. 고찰 117
• 제5장 Yeast를 이용한 BRs 생산 120
• Ⅰ. 서론 120
• Ⅱ. 재료 및 방법 121
• 1. Selection of positive clone in N3 medium 121
• 2. Innoculation of transformed yeast in YPG 122
• 3. Harvest and resuspended in YPL 122
• 4. Dilution with Fresh YPL ( OD550=0.5 ) and Hormone Feeding 123
• 5. Hormone Feeding 123
• 6. Ethylacetate extraction 123
• 7. Sep-Pak C18 Cartridge Chromatography 124
• 8. Reversed phase HPLC 124
• 9. Derivatization 125
• 10. GC-Mass 125
• Ⅲ. 결과 126
• 1. Yeast/WAT21 line에서 CS의 동정 126
• 2. Yeast/WAT21 line에서 BRs의 생합성 127
• 2-1. TE에서 3-DHT로의 전환 129
• 2-2. TE에서 TY로의 전환 130
• 2-3. TY에서 CS로의 전환 131
• 3. D6 CR 전환 133
• 3-1. D6 CS확인 133
• 3-2. D6 TY확인 134
• Ⅳ. 고찰 135
• 제6장 종합토의 137
• References 145
• 국문초록 165
• Abstract 169