Development of surface sandwich assays with aptamer-antibody pairs for the analysis of cancer specific biomarker concentrations : x암 바이오마커의 농도 측정을 위한 압타머-항체 표면 샌드위치 분석법 개발

국문 초록 (Abstract)

유방암 및 대장암의 잠재적인 바이오마커로 알려진 PTK7, hnRNP A1에 특화된 새로운 DNA 압타머-항체 샌드위치 어세이를 개발하여 SPCE를 이용한 전압법 및 금 칩을 이용한 표면 플라스몬 공명 센싱 플랫폼에 적용하였으며, 인체 시료 분석에 성공적으로 적용되었다. 먼저 유방암 단백질 바이오마커인 PTK7을 SPCE 기반의 전기화학 센싱 디바이스를 이용하여 검출하는 연구를 수행하였다. PTK7의 고선택적 검출을 위하여 PTK7의 서로 다른 위치에 특이적으로 결합하는 프로브(항체와 DNA 압타머)를 선정하였고, 금 나노입자가 도포된 SPCE 전극에 압타머, PTK7, ALP 효소가 컨쥬게이션된 PTK7 항체를 순차적으로 흡착시켜 표면 샌드위치 복합체를 형성한 후 APP 기질과 반응시켜 ALP와의 효소 반응에 의한 전기화학적 신호를 측정함으로써 PTK7을 정량적으로 검출하였다.(0.1 ~ 10 pM) 또한 실제 시료 안에 존재하는 다양한 단백질의 센서 신호 방해 효과를 상세하게 조사하였다. 이를 이용하여 합리적인 수준의 PTK7을 검출할 수 있었고(137.21 pM), 개발된 센서를 실제 세럼 샘플 적용하여 PTK7을 전기화학적으로 분석할 수 있는 가능성을 제시하였다.두번째로 대장암 단백질 바이오마커인 hnRNP A1를 DNA 압타머-항체 샌드위치 어세이 기반의 표면 플라스몬 공명 센싱플랫폼을 이용하여 인체 혈장시료의 농도 분석에 성공적으로 적용되었다. 실제시료 분석 이전에 샌드위치 어세이 기반에서 항체의 농도(90 nM)를 조절하여 단백질 바이오마커 농도의 검출범위(0.25 ~ 5 nM)를 결정하는 연구를 수행하였고, 문헌에서 보고된 일반 대조군과 환자 시료 내에 존재하는 농도범위에 알맞게 검출할 수 있었다. 또한, 상업용 ELISA kit를 사용한 비교 측정에서는 SPR 기반 샌드위치 측정이 더 넓은 범위를 가진다는 것을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Aptamer-antibody sandwich sensing platforms with voltammetric and surface plasmon resonance (SPR) techniques are demonstrated to analyze breast and colorectal cancer biomarkers including protein tyrosine kinase 7 (PTK7) and heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A1 (hnRNP A1), respectively. The detection of PTK7 was performed through the formation of a surface bound DNA aptamer/PTK7/anti-PTK7 complex on gold nanoparticles (AuNPs) modified screen printed carbon electrode (SPCE). Cyclic voltammetry (CV) and different pulse voltammetry (DPV) were used for the quantitative detection of PTK7 via the APP–ALP reaction using our developed sandwich platform. Based on a series of results, the PTK7 in normal human serum solutions was analyzed by using our developed sandwich platform. In addition, the SPR technique was used to detect hnRNP A1 biomarkers using a sandwich platform developed by the specific adsorption of biomarkers from buffer onto DNA aptamer immobilized on a gold surface by covalent linking, and then the subsequent binding of antibody. We further apply it to the direct analysis of pooled colorectal cancer plasma solutions. A plasma analysis result using SPR was compared with a result obtained from a commercial enzyme-linked immunosorbent assay kit (ELISA).

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1. An overview of cancer biomarker 2
• 1.2. Electrochemical biosensor 4
• 1.3. SPR biosensor 7
• 1.4. Aptamer surface sandwich assay 10
• 1.5. Scope of the present thesis 12
• 2. SPR study for biomolecules with a pair of bioreceptors 14
• 2.1. Introduction 15
• 2.2. Experimental section 16
• 2.2.1. Materials 16
• 2.2.2. Bioreceptors modifications on SPR chips 17
• 2.2.3. SPR measurements 17
• 2.3. Result and discussion 18
• 2.3.1. Binding strength and sandwich assay research 18
• 3. Electrochemical biosensor for PTK7 breast cancer biomarker 35
• 3.1. Introduction 36
• 3.2. Experimental section 38
• 3.2.1. Reagents and materials 38
• 3.2.2. Measurement of electrochemical sensor 39
• 3.2.3. AuNPs electrochemical deposition on SPCE 39
• 3.2.4. Preparation of DNA aptamer modified working electrode 39
• 3.3. Result and discussion 41
• 3.3.1. Sensing strategy for PTK7 biomarker concentrations 41
• 3.3.2. PTK7 protein biomarker quantitative detection in buffer 42
• 3.3.3. The concentration of PTK7 in serum sample solution was determined 54
• 3.4. Conclusions 57
• 4. SPR biosensor for hnRNP A1 colorectal cancer biomarker 58
• 4.1. Introduction 59
• 4.2. Experimental section 64
• 4.2.1. Materials 64
• 4.2.2. SPR chips with DNA aptamer or antibody modifications 65
• 4.2.3. SPR biosensor process of performing analysis 65
• 4.3. Results and discussion 67
• 4.3.1. Detection of protein biomarker using SPR biosensor 67
• 4.3.2. Sandwich assay for hnRNP A1 in buffer 69
• 4.3.3. Sandwich assay for hnRNP A1 in plasma 74
• 4.3.4. ELISA test for measuring hnRNP A1 concentrations 77
• 4.4. Conclusions 80
• 5. Conclusions 81
• 6. Reference 84
• Abstract 96
• Copyrights 99

참고문헌 (Reference)

• 1 K.L . Gorringe , A. Boussioutas , and D.D.L . Bowtell ,, "Genes Chromosom", 42 , 247-259 ., 2004