과채주스의 항산화 효과 및 C57BL/6 마우스에서의 대장암 억제효과 = A fruit and vegetable juice exhibits antioxidant activity and anticolorectal cancer effects in C57BL/6 mice.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Recently, as interest in antioxidants has increased, the number of people who want to consume vegetables or fruits containing a lot of phytochemicals in the form of raw foods such as salads has increased. However, eating cooked vegetables rather than eating them as raw improves the absorption rate of nutrients and phytochemicals that are good for health. In this study, fruits and vegetables containing various phytochemicals, such as apples, cabbage, tomatoes, carrots, and broccoli, were mixed to prepare the fruit and vegetable juices with or without heat treatment. The purpose of this study was to investigate the juices showed antioxidant effect and the effect of suppressing colorectal canacer in C57BL/6 mice.
Total polyphenol content, total flavonoid content, DPPH radical scavenging ability, and ABTS radical scavenging ability were measured to find out the antioxidant activity of the fruit and vegetable juice. The anticaner effect of the juice with or without heat treatment was confirmed in C57BL/6 mice induced with AOM/DSS for colorectal cancer. The sample was divided in the following groups: AIN-93G diet group (Normal, Nor), colon cancer induced with AIN-93G diet group (Control, Con), colon cancer induced and 10% heat treated the fruit and vegetable juice diet group (A), colon cancer induced and 10% the raw fruit and vegetable juice diet group (B). The effect on colon length, colon weight/length ratio, numbers of tumor, colon pathological analysis, and expression of apoptosis-related genes were studied.
The total polyphenol content increased with concentration gradient in all samples, and in particular, heat-treated fruit and vegetable juice (A) showed significantly the highest value at a concentration of 10 mg/mL to 25.0±0.29 mg galic acid equivalent (GAE)/g. It was confirmed that the total flavonoid content also increased in a concentration gradient of 2-10 mg/mL, and group A showed the highest amount of total flavonoid content. In addition, the DPPH radical scavenging effect of the juice was increased with a concentration gradient in both sample at 2, 5, and 10 mg/mL concentration. The antioxidant effect in the heat-treated juice group (A) was higher than in the group B at all concentrations. ABTS radical scavenging activity also showed that group A had a significantly higher ABTS radical scavenging activity than group B at a concentration of 5 mg/mL, 87.8±3.03 (%).
In case of the length and weight of the colon, the group that consumed the heat-treated juice showed the almost same level of the Nor that did not induce colorectal cancer, and the tumor numbers also significantly reduced in the mice. As a result of tissue pathological observation through H&E staining, it was confirmed that tissue infiltration and tumor formation were also significantly reduced. In addition, protein expression of Bcl-2, and Bcl-xL, which are factors related to colon apoptosis, was lowest in the heat-treated juice group. Protein expression of Bax, caspase 3, and caspase 9 was the most highly expressed in the heat-treated juice group. Also, protein expression of p53, cell cycle-related fators, was also the most expressed in the heat-treated juice group, and proinflammatory cytokine of IL-6 and inflammation-related genes such as iNOS, COX-2 were the lowest in the heat-treated juice group.
Therefore, it was found that the antioxidant and anticancer effects of the fruit and vegetable juice were changed according to the process of heat treated. Functional substances such as lycopene from tomatoes and beta-carotene from carrots are converted into forms that can be easily available in the mice body through the heat treatment, which resulted in high antioxidant and anticancer effects. It is thought that the production of fruit and vegetable juice and especially by the process showed excellent anticancer effects, increased apoptosis, arrested the cell cycle, inhibited colon cancer induction.
The juice doesn’t regulated cytokine IL-6 and inflammation related proteins of iNOS and COX-2.

국문 초록 (Abstract)

최근 항산화에 대한 관심이 많아지면서 파이토케미컬(phytochemical) 등이 많이 함유된 채소나 과일 등을 샐러드와 같은 생식의 형태로 섭취하고자 하는 사람들이 증가하였다. 그러나 채소를 생으로 먹는 것보다 익혀 먹는 것이 파이토케미컬 등 건강에 좋은 영양소의 흡수율을 증진시킨다. 따라서, 본 연구는 양배추, 브로콜리, 토마토, 당근, 사과, 바나나 등 여러 파이토케미컬을 함유하는 과일과 채소를 혼합한 과채주스의 효과를 알아보고, 특히 과채주스의 열처리 유무에 따른 항산화 효과뿐 아니라, AOM/DSS로 유도된 염증성 대장암 동물실험 모델을 이용하여 대장암을 억제하는 효과를 알아보고자 하였다.
과채주스의 항산화 활성을 알아보고자 총 폴리페놀 함량, 총 플라보노이드 함량, DPPH 라디칼 소거능, ABTS 라디칼 소거능을 측정하였다. AOM/DSS로 대장암이 유도된 C57BL/6 마우스에서 전처리 조건에 따른 과채주스의 항암 효과를 확인하였다. AIN-93G 일반 사료를 섭취한 대조군(Normal), AOM/DSS로 대장암을 유도하고 AIN-93G 일반 사료를 섭취한 대조군(Control), AOM/DSS로 대장암을 유도하고 10%의 열처리 과채 주스가 함유된 사료를 섭취한 실험군(A), AOM/DSS로 대장암을 유도하고 10% 열처리 하지 않은 과채 주스를 섭취한 실험군(B)로 나누어 실험을 진행하였다. 대장의 길이와 대장 무게/길이 비율, 종양 개수, 대장의 병리학적 분석, apoptosis 관련 유전자의 발현에 미치는 효과에 대해 알아보았다.
총 폴리페놀 함량은 과채주스를 함유한 모든 샘플에서 농도 구배적으로 증가하였으며, 특히 열처리 과채주스(A)가 10 mg/mL 농도에서 25.0±0.29 mg gallic aicd equivalent (GAE)/g으로 유의적으로 가장 높은 값을 보였다. 총 플라보노이드 함량 역시 과채주스 함유 2-10 mg/mL 농도에서 농도 구배적으로 증가하는 것을 확인하였으며, A가 가장 많은 양의 총 플라보노이드 함량을 나타내었다. 또한, 과채주스의 DPPH radical 소거 효과는 2, 5, 10 mg/mL 농도에서 과채주스를 포함한 두 샘플 모두 농도 구배로 증가하였다. 열처리 과채주스(A)군에서 항산화 효과는 모든 농도에서 B 군보다 높았다. ABTS 라디칼 소거능 역시 A군이 5 mg/mL 농도에서 87.8±3.03 (%)으로 B군 60.2±1.49 (%) 보다 유의적으로 높은 ABTS 라디칼 소거능 효과를 나타내었다.
15주간의 대장암 억제 동물 실험 결과, 대장의 길이와 무게의 경우, 과채주스를 함유한 사료를 먹인 군들 모두가 일반사료만을 섭취한 대조군보다 정상군 수준에 가깝게 억제된 것으로 나타났으며, 특히 열처리를 한 과채주스를 섭취한 군이 대장암을 유도하지 않은 정상 대조군 수준으로 나타났으며, 종양 또한 상당히 줄어든 것으로 나타났다. 또한 이들은 H&E 염색을 통한 조직의 병리학적 관찰 결과에서도 조직의 침윤이나 종양 생성도 현저하게 줄어드는 것을 확인하였다. 또한 대장의 apoptosis 관련 인자인 BcL-2, BcL-xL의 단백질 발현이 과채주스 함유 사료를 섭취한 군들에게 모두 낮게 나타났으며, 열처리를 한 과채주스 군에서 가장 낮게 발현되었다. pro-atoposis 관련 인자인 Bax, caspase 3, caspase 9의 단백질 발현은 열처리를 한 과채주스 군에서 가장 많이 발현되었다. Cell cycle 관련 인자인 p53의 단백질 발현 역시 열처리를 한 과채주스 군에서 가장 많이 발현하였으며 pro- inflammatory 관련 인자인 IL-6와 inflammation 관련 인자인 iNOS, COX-2의 단백질 발현은 과채주스 함유 사료를 섭취한 군들에서 많이 억제되었으며, 특히 열처리를 한 과채주스 군에서 가장 낮게 발현되었다.
따라서, 전처리 조건에 따라 과채주스의 항산화 및 항암효과의 변화가 나타남을 알 수 있었다. 토마토의 라이코펜, 당근의 베타-카로틴과 같은 기능성 물질들이 열처리를 통해 체내에 쉽게 사용될 수 있는 형태로 전환되어 높은 항산화 효과와 항암 효과를 나타낸 것으로 생각된다. 이 연구의 결과로 양배추, 토마토, 브로콜리, 당근, 사과, 바나나를 열처리하여 과채주스를 제조하면 항암 효과가 우수하여 apoptosis(세포사멸)를 유도하고 세포주기를 정지시키며 염증성 사이토카인을 조절하여 대장암의 발생 및 증식을 억제 할 것이라고 생각된다.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. 서론 1
• 1. 연구 배경 1
• 2. 연구 목적 7
• Ⅱ. 문헌 조사 8
• 1. 산화적 스트레스와 암 8
• 가. 활성산소종(ROS)와 활성질소종(RNS) 8
• 나. 산화 스트레스와 암의 발생 9
• 다. 항산화제와 암 10
• 2. 염증 13
• 가. 염증과 그 기전 13
• 나. 염증성 장질환 13
• 3. 암세포의 발암 기전과 항암효과 15
• 가. 암세포의 세포사멸(apoptosis) 18
• (1) Bcl-2 family 18
• (2) caspase family 19
• 나. 암세포의 세포주기 억제 메커니즘 19
• Ⅲ. 연구방법 21
• 1. 전처리 방식에 따른 과채주스의 항산화 효과 21
• 가. 시료 선정 및 제조 21
• 나. 과채주스의 추출물 제조 25
• 다. Total polyphenol 함량 측정 25
• 라. Total flavonoid 함량 측정 26
• 마. DPPH 라디칼 소거활성 측정 26
• 바. ABTS 라디칼 소거활성 측정 26
• 2. C57BL/6 마우스에서 AOM/DSS로 유도된 대장암
• 억제 효과 28
• 가. 실험동물 준비 및 군 구성 28
• 나. 마우스 식이 준비 28
• 다. 시료의 투여 및 대장암 유발 29
• 라. 실험동물의 체중 변화량 분석 29
• 마. 대장 길이 및 장기 무게, 종양 개수 측정 29
• 바. 대장 및 간 조직의 병리학적 검사 30
• 사. Western blot을 이용한 조직 내 단백질 발현 측정 32
• 아. 통계 처리 32
• Ⅳ. 결과 34
• 1. 전처리 방식에 따른 과채주스의 항산화 효과 34
• 가. Total phenolic 함량 측정 34
• 나. Total flavonoid 함량 측정 34
• 다. DPPH radical 소거효과 측정 34
• 라. ABTS 라디칼 억제 효과 35
• 2. C57BL/6 마우스에서의 AOM/DSS로 유도된 대장암 억제 효과 40
• 가. 체중 40
• 나. 장기무게 40
• 다. 대장 길이 및 대장 무게/길이 비율 40
• (1) 대장 길이 41
• (2) 대장 무게/길이 비율 46
• 라. 대장 조직 내 종양 개수 46
• 마. 대장 조직의 병리학적 관찰 46
• 바. Western blot을 이용한 대장 조직 내 단백질 발현 측정 47
• (1) Apoptosis 관련 유전자의 단백질 발현 47
• (2) Cell cycle 관련 유전자의 단백질 발현 51
• (3) Inflammation 관련 유전자의 단백질 발현 51
• Ⅴ. 고찰 58
• 1. 재료 58
• 가. 품목 선정 58
• 나. 유기농 원료 58
• 다. 부위 (껍질 이용) 59
• 라. 과채주스의 열처리 효과 60
• (1)항산화 물질 생성 60
• (2) 안전한 보관 및 유통 60
• (3) 다른 가공의 한계 61
• (4) 소화흡수력 증진 61
• (5) 열처리 온도 설정 65
• 2. 항산화 효과 66
• 3. 항암 효과 69
• Ⅵ. 결론 74
• 참고문헌 77
• 국내 77
• 국외 86
• <ABSTRACT> 113

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