NMR study of the hZαADAR1-Z-DNA containing artificial nucleobase 2’O-methyl guanosine complexes = 인공핵염기 2'OMe구아노신을 포함하는 Z-DNA와 hZαADAR1 복합체에 관한 핵자기공명 연구

국문 초록 (Abstract)

유전적 정보를 담고 있는 DNA는 여러가지 구조를 가지는데, 대표적으로 B-DNA와 Z-DNA가 있다. 가장 일반적인 DNA의 형태는 B-DNA인데 음성초나선, 고농도의 염 상태 및 Z-DNA 결합 단백질과의 복합체 형성 조건 하에서 B-DNA에서 Z-DNA로 B-Z 전이가 유도된다고 알려져 있다. Z-DNA 결합 단백질 중 human Adenosine deaminase acting on RNA 1 (hADAR1)은 높은 B-Z 전이 활성을 가진 단백질로, B-DNA와 결합하여 Z-DNA로 구조변화를 일으키는 부분인 Zα 도메인을 가지고 있다. 최근 다양한 연구실에서 5’-CGCGCG-3’서열의 4번째 G에 변형 구아닌 유도체를 도입하여 B-Z 전이 및 Z-DNA의 안정화 능력을 평가하는 연구들이 진행되어왔다.
본 연구에서는 RNA와 DNA 사이의 자연발생적인 생물학적 중간상태로 여겨지는 인공핵염기 2'O-methyl guanosine을 5’-CGCGCG-3’서열의 4번째 G에 도입하였다(이후 4m-d(CG)3으로 표기). 2차원 NOESY (Nuclear Overhauser effect spectroscopy) NMR 연구를 통해 4m-d(CG)3의 백본 어싸인먼트를 수행하였다. DNA-단백질 상호작용 연구를 위해서는 ADAR1의 Zα도메인인 hZαADAR1과 4m-d(CG)3의 적정 실험을 진행하였다. hZαADAR1과 4m-d(CG)3의 적정과정마다 4m-(CG)3의 이미노 양성자 스펙트럼을 분석하였고, hZαADAR1복합체의 1H-15N Heteronuclear Single-Quantum Correlation (HSQC)를 관찰하여 유도된 B-Z 전이 활성을 확인하였다. 이러한 NMR 데이터를 바탕으로 복합체의 상대적인 Z-DNA 비율과 HSQC에서의 화학적 변화 섭동이 관찰되었다. 본 연구는 이전의 RNA 및 DNA 데이터와 비교하여 2'OMe 구아노신을 도입한 Z-DNA와 hZαADAR1 사이의 B-Z 전이의 분자 메커니즘에 대한 견해를 제공한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The genetic material DNA has a variety of structures like B-form and Z-form. The most common structure of DNA is B-DNA, which is known to induce B-Z transition from B-DNA to Z-DNA under the conditions of high salt, negative supercoiling, and complex formation with a Z-DNA-binding protein. Among the Z-DNA binding protein, human Adenosine deaminase acting on RNA 1 (hADAR1) is the protein with the high B-Z Transition activity. It contains Zα domain which is known as the part that binds to B-DNA and causes the B-Z structural transition to Z-DNA. Recently, nucleotide modification studies have been conducted in various laboratories to evaluate B-Z transition activity and stability by introducing modified guanine derivatives in the fourth G of the 5'-CGCGCG-3' sequence.
In this study, I incorporated 2'O-methyl guanosine, believed to be a naturally occurring biological intermediate state between RNA and DNA, into G4 of 5’-CGCGCG-3’ (hereinafter referred to as 4m-d(CG)3). Two-dimensional nuclear overhauser Effect Spectroscopy (NOESY) was used for assignment of designed DNA. For the protein binding study, Zα domain of the Z-DNA binding Protein (hZαADAR1) was used. In order to investigate the B-Z transition induced by 4m-(CG)3, I analyzed the imino proton spectra of 4m-(CG)3 during titration with hZαADAR1 and monitored the 1H-15N chemical shift perturbations of hZαADAR1 during titration with 4m-(CG)3 using Heteronuclear Single-Quantum Correlation (HSQC). Based on these data, the relative Z-DNA population and chemical shift perturbation of complex were determined. This study provides insights into the molecular mechanism of the B-Z transition of a DNA duplex induced by hZαADAR1 and the Z-DNA containing artificial nucleobase 2'O-methyl guanosine in comparison to previous RNA and DNA data.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. Introduction 1
• 1. B-DNA and Z-DNA 1
• 2. Biomolecular NMR spectroscopy 4
• 1) 1H NMR 4
• 2) 1H-1H NOESY 4
• 3) 1H-15N HSQC 4
• 4) Triple resonance NMR 9
• Ⅱ. NMR study on the human ZαADAR1-Z-DNA containing artificial nucleobase 2’O-methyl guanosine complexes 11
• 1. Abstract 11
• 2. Purpose of this experiment 15
• 3. Materials and Methods 16
• 1) Nucleic acid 16
• 2) Protein Over-expression and Purification 16
• A. Production of cell extract 17
• B. Affinity chromatography 19
• C. GPC 19
• 4. Results 22
• 1) Assignment of 4m-d(CG)3 22
• 2) Temperature dependence of d(CG)3 and 4m-d(CG)3 25
• 3) DNA-Protein Binding study 27
• 5. Discussion 33
• Ⅲ. Assignment of fusion protein hZαADAR1-E3L 35
• 1. Abstract 35
• 2. Materials and Methods 38
• 1) Protein Over-expression and Purification 38
• 2) NMR experiments 38
• 3. Results 41
• 1) 1H-15N HSQC 41
• 2) Backbone assignment 42
• Ⅳ. Reference 46