Development of FRET-based Terephthalic Acid Sensors by Genetically Incorporating a Fluorescent Amino Acid

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Polyethylene terephthalate (PET) has become the most commonly used plastic for food packaging and beverage containers due to its transparent and durable properties. However, because of its slow hydrolysis rate, discarded PET continues to accumulate in the soil and oceans, creating a global environmental problem. As a solution to this problem, research on improving PET hydrolysis enzymes found in some microorganisms and fungi to increase their activity has been attracting much attention, but it is difficult to quantitatively compare the activity of improved enzymes because there is still a lack of analytical methods to quickly and accurately quantify the amount of hydrolyzed PET on a large scale.
In this study, we genetically introduced the fluorescent non-natural amino acid L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine (CouA) into the protein TphC, found in Comamonas sp. strain E6, which binds to terephthalic acid (TPA), the end product of PET hydrolysis, to create a FRET-based sensor. CouA is used as the FRET donor, while yellow fluorescent protein (YFP) is fused to the N-terminus of TphC as the FRET acceptor. The amino acid residues with the largest distance difference when the structure of the protein changed before and after TPA binding were selected as the CouA introduction site, and when CouA was introduced at the position of N190 Asparagine, the FRET ratio of the sensor protein became 2.07 times that before TPA binding, and the binding affinity was almost similar to the binding affinity of the original TphC protein. However, selectivity assays showed that the sensor protein also sensed mono-(2-hydroxyethyl)terephthalate (MHET), an intermediate product of PET hydrolysis, with a signal of about 1/15 of the TPA signal, which could be improved by changing the amino acid residues in the TPA recognition site of TphC to increase selectivity. If this problem is solved, it is expected to be an effective TPA assay method that can be applied to multiple samples simultaneously and has a low minimum detectable TPA concentration, reducing the time required for the PET hydrolysis process to verify enzyme activity and shortening the time required for the assay itself. It is also expected that the same design principle can be utilized to create sensors that detect degradation products of plastics other than PET.

국문 초록 (Abstract)

폴리에틸렌 테레프탈레이트 (PET)는 투명하고 내구도 높은 성질로 인해 식품 포장이나 음료 용기로 가장 많이 사용되는 플라스틱이 되었다. 한편, PET의 느린 가수분해 속도로 말미암아 버려진 PET는 토양이나 바다에 계속 축적되어 전지구적인 환경 문제로 발전하고 있다. 이에 대한 방안으로써 일부 미생물이나 곰팡이류에서 발견되는 PET 가수분해 효소를 개선하여 그 활성을 높이는 연구가 큰 주목을 받으며 진행되고 있으나, 가수분해된 PET의 양을 대규모로 빠르고 정확하게 정량할 분석법이 아직 미비하여 개선된 효소들의 활성을 정량적으로 비교하는 데 어려움을 겪고 있다.
이번 연구에서는 Comamonas sp. strain E6에서 발견된, PET 가수분해의 최종 생성물인 테레프탈산 (TPA)에 결합하는 단백질 TphC에 형광 비천연아미노산 L-(7-hydroxycoumarin-4-yl) ethylglycine (CouA)을 유전적으로 도입하여 FRET 기반 센서를 만들어냈다. CouA가 FRET 주게 (donor)로 사용되는 한편, 황색형광단백질 (YFP)은 FRET 받게 (acceptor)로써 TphC의 N-말단에 fusion되어 있다. TPA 결합 전후로 단백질의 구조가 변화했을 때의 거리차가 가장 큰 아미노산 잔기들을 CouA 도입 위치로 하였으며, CouA가 N190 Asparagine 위치에 도입되었을 때 센서 단백질의 FRET ratio가 TPA 결합 전의 2.07배가 되고 원본 TphC 단백질의 binding affinity와 거의 유사한 binding affinity를 나타내었다. 다만 Selectivity assay 결과 센서 단백질이 TPA signal의 약 1/11 정도의 signal로 PET 가수분해의 중간 생성물인 Mono-(2-hydroxyethyl)terephthalate (MHET) 역시 센싱한다는 것이 밝혀졌는데, 이는 추후 TphC의 TPA 인식 자리의 아미노산 잔기를 변경하여 선별성을 높이는 것으로 개선할 수 있을 것으로 보인다. 그 문제만 해결된다면, 동시에 다수의 샘플에 적용이 가능하면서도 감지 가능한 최소 TPA 농도가 낮아 효소 활성 검증을 위한 PET 가수분해 과정에 걸리는 시간을 단축할 수 있으며 assay 자체에 걸리는 시간도 짧은, 효과적인 screening 방법이 되리라 기대된다. 또한 같은 디자인 원리를 활용하여 PET 외의 플라스틱의 분해 생성물을 감지하는 센서 또한 제작할 수 있을 것으로 예상된다.

목차 (Table of Contents)

• 1. Introduction 1
• 1.1 Genetic Incorporation of Unnatural Amino Acids into Protein ·1
• 1.2 FRET-based Sensors 3
• 1.3 Importance of Terephthalic Acid Sensing 5
• 2. Experimental Section 7
• 2.1 General 7
• 2.2 Cloning Information 7
• 2.3 Expression and Purification of Sensor Protein 12
• 2.4 TPA Titration & Selectivity Test for TPA Analogs 13
• 3. Result and Discussion 14
• 3.1 Sensor Protein Design 14
• 3.2 CouA Incorporation Check by SDS-PAGE Imaging 25
• 3.3 FRET Ratio Measurement of Sensor Proteins with TPA 26
• 3.4 Selectivity Test for Sensor Protein 28
• 4. Conclusion 30
• 5. References 32