서양애기장대에서 Brassinosteroids 신호에 의한 식물 호르몬의 함량조절 분자기전

국문 초록 (Abstract)

식물호르몬은 식물의 생장과 발달을 조절함에 있어서 복잡한 상호작용을 가진다. 그 중 특정 식물 호르몬에 의한 신호가 다른 식물 호르몬의 다양한 생리작용을 조절 기작이 존재할 것으로 예상하였다. 이에 본 연구에서는 brassinosteroids (BRs)의 신호전달에 의해 abscisic acid (ABA)와 ethylene의 함량 변화 조절 기작을 분자 수준에서 이해하고자 하였다.
먼저, ABA 생합성 유전자인 ABA2의 BRs에 의한 발현 변화를 조사하였다. Brassinolide (BL) 농도에 dependent하게 ABA2의 발현이 감소되었고, BL 처리 초기에 가장 크게 감소하는 것을 확인하였다. 또한, BRs deficient mutants인 det2, cyp85a1a2와 BRs dominant mutants인 bes1-D, bzr1-1D내에서 각각 ABA2 발현의 증가, 감소를 통해 BRs에 의해 ABA2의 발현이 down- regulation됨을 알 수 있었다. 이러한 BRs에 의한 반응은 GUS reporter gene system을 이용하였을 때에도 마찬가지로 BL과 BRZ 처리에 따라 각각 감소와 증가가 나타났다. 또한 ABA2-GUS는 식물의 vascular tissue에서 발현하였는데, 다른 ABA 생합성 유전자들과 함께 ABA 생합성에 작용하는 부위로 예상하였다. EMSA결과에서 BRs에 의한 ABA2 발현 조절은 BRs transcription factors인 BES1과 BZR1의 직접적인 binding을 통해 일어나는 것임을 확인하였다. 그리고 ABA 내생 함량 측정 결과, det2와 cyp85a1a2에서는 높은 함량이, bes1-D와 bzr1-1D에서는 낮은 함량이 측정되어 ABA2 발현 변화에 따라 ABA 내생 함량이 달라지는 것을 알 수 있었다. 이러한 ABA 함량 변화로 인해 bes1-D와 bes1 KO은 ABA에 대한 민감성의 차이가 나타나 발아율과 GA 생합성 유전자, 그리고 α-amylase 발현의 변화를 확인하였다.
Ethylene 생합성 유전자인 ACO4는 식물의 root보다 shoot에서 강하게 발현하며, 이러한 발현은 BL 농도에 따라 감소하는 것을 확인하였다. 또한 BRs deficient mutants에서 증가, BRs dominant mutants에서 감소하는 발현 변화를 통해 ACO4는 BRs에 의해 down-regulation되는 것을 알 수 있었다. 본 연구에서 애기장대 내에서 ACO4의 조직 특이적 발현을 GUS를 이용하여 최초로 확인하였는데, 주로 shoot의 vascular tissue와 true leaf, stomata, trichome에서 관찰되었다. 그리고 BL과 BRZ 처리에 의해 GUS activity와 ACO4 transcript level의 감소와 증가가 나타나 BRs에 의한 ACO4 발현 감소 효과를 확인하였다. 그러나 bzr1-1D에서는 ACO4의 발현이 크게 감소한 반면, bes1-D에서는 큰 변화가 나타나지 않았다. 이는 BZR1 단백질만이 ACO4 promoter의 BRRE에 binding 한 EMSA결과를 통해 ACO4의 발현 조절에는 BZR1의 직접적인 영향이 크게 작용한다는 것을 다시 확인하였다. ACO4 과발현체를 제작하여 그 표현형을 관찰한 결과, 짧은 hypocotyl 길이를 가지며 ethylene 생합성 억제제인 cobalt ion 처리에 의해서 표현형 회복이 일어남에 따라 ACO4는 식물의 shoot 생장을 억제한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 BRs는 ACO4의 발현을 감소시켜 shoot의 생장을 유도할 것이라 생각한다.
본 연구에서는 이러한 결과들을 통해 ABA 생합성 유전자 ABA2와 ethylene 생합성 유전자 ACO4의 발현이 BRs에 의해 조절되고, 그에 따라 호르몬 함량이 변화되어 식물의 발아율과 shoot의 발달을 조절하고 있음을 알 수 있었다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Plant hormones have complex interactions to control plant growth and development. Various physiological functions from many phytohormones can be regulated by a single hormone signal. In this study, molecular regulations for homeostasis of ABA and ethylene by brassinosteroids were investigated.
When brassinolide (BL) was exogenously applied, ABA biosynthetic gene, ABA2, expression was decreased at early phase of application. BR deficient mutants, det2 and cyp85a1a2, showed increased expression level of ABA2 and BR dominant mutants of BR transcription factors, bes1-D and bzr1-1D, showed decreased level. Next, tissue specific expression of ABA2 was examined using GUS reporter gene system. The change of ABA2 expression was detected by application of BL and BRZ, confirming that ABA2 transcript level is controlled by BR signalling. Also, pABA2-GUS was observed in vascular tissues where ABA biosynthesis might occur with other ABA biosynthetic genes. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) showed that BES1 and BZR1 control ABA2 expression by direct binding to E-box sequences in putative promoter region of ABA2. Moreover, endogenous levels of ABA were increased in det2 and cyp85a1a2, and decreased in bes1-D and bzr1-1D. Also, bes1-D and bes1 KO had different ABA sensitivity so that could change germination rates and expression levels of GA biosynthetic genes and α-amylase.
Ethylene biosynthetic gene, ACO4, was strongly expressed in shoot rather than root. ACO4 transcript level was decreased at early phase of BL application by concentration dependent manner. Consistently, GUS activity and transcript level of ACO4 were decreased and increased by application of BL and BRZ, respectively. In this study, ACO4 tissue specific expression patterns were discovered for the first time and pACO4-GUS was mainly observed in shoot, especially vascular tissue, true leaf, stomata and trichome.
Interestingly, in bzr1-1D, ACO4 transcript level was decreased, but was not changed in bes1-D. According to EMSA results, only BZR1 bound to BRRE sequence in putative promoter region of ACO4 and these results indicate that BZR1 affects regulation of ACO4 expression. Additionally, ACO4 over expression mutant was produced. Short hypocotyls of 35S-ACO4 transgenic plants were rescued by treatment of ethylene biosynthesis inhibitor, cobalt ion, representing ACO4 inhibits hypocotyl elongation. These results suggest that BRs induces shoot growth through decrease ACO4 expression in shoot.
Considering these results, it can be concluded that BRs control germination and shoot growth by regulation of ABA and ethylene biosynthesis through direct binding to the promoter of ABA2 and ACO4.

목차 (Table of Contents)

• 제 1장 종합서론 1
• 1. 식물 호르몬의 상호작용 1
• 2. Brassinosteroids (BRs)의 신호전달경로 4
• 3. 연구목적 8
• 제 2장 Brassinosteroids의 Abscisic acid 생합성 조절 10
• I. 서론 10
• II. 재료 및 방법 13
• 1. 식물재료 13
• 2. 대상 식물의 생육 13
• 3. 유전자의 발현 양상 조사 13
• 3-1. Total RNA의 추출 13
• 3-2. RT-PCR 14
• 3-3. qRT-PCR 14
• 4. pABA2-GUS 형질전환 식물체 제작 15
• 4-1. Genomic DNA 추출 15
• 4-2. ABA2 putative promoter의 cloning 16
• 1) ABA2 유전자의 putative promoter full length cloning 16
• 2) ABA2 유전자의 putative promoter의 binary vector내로 도입 17
• 4-3. Agrobacterium을 통한 식물체로의 형질전환 17
• 4-4. Agrobacterium-mediated plant transformation 18
• 4-5. pABA2-GUS 형질전환체 선별 18
• 5. Whole-mount GUS staining 19
• 6. GUS 정량 20
• 7. ABA2와 BES1 protein의 in vitro binding assay 20
• 7-1. 단백질 발현 유도 및 정제 20
• 1) MBP fusion BES1 단백질 발현 유도 및 정제 20
• 2) MBP fusion BZR1 단백질 발현 유도 및 정제 21
• 7-2. Probe 제작 21
• 7-3. EMSA 22
• 8. 애기장대로부터 ABA 추출 및 정제 23
• 8-1. Solvent-partitioning에 의한 ABA의 분리 23
• 8-2. Sep-Pak C18 cartridge column에 의한 정제 23
• 8-3. Reversed phase HPLC를 통한 정제 23
• 8-4. Derivatization 24
• 8-5. GC-SIM/MS 분석 24
• 8-6. ELISA 분석 24
• III. 결과 26
• 1. BRs에 의한 ABA2 발현 변화 26
• 1-1. qRT-PCR을 통한 ABA2 발현 변화 26
• 1-2. ABA2의 시공간적 발현 양상 분석 30
• 2. BES1/BZR1의 ABA2 promoter 결합 확인 39
• 2-1. EMSA를 통한 in vitro binding 39
• 3. ABA 내생 함량 분석 45
• 4. 표현형 변화 관찰 50
• IV. 고찰 55
• 제 3장 Brassinosteroids의 Ethylene 생합성 조절 60
• I. 서론 60
• II. 재료 및 방법 62
• 1. 유전자의 발현 양상 조사 62
• 2. pACO4-GUS 형질전환 식물체 제작 62
• 2-1. ACO4 유전자의 putative promoter cloning 62
• 2-2. ACO4 유전자의 putative promoter의 binary vector내로 도입 63
• 2-3. Agrobacterium을 통한 식물체로의 형질전환 63
• 2-4. Agrobacterium-mediated plant transformation 64
• 2-5. pACO4-GUS 형질전환체 선별 64
• 3. Whole-mount GUS staining 64
• 4. GUS 정량 64
• 5. ACO4와 BES1 protein의 in vitro binding assay 64
• 5-1. 단백질 발현 유도 및 정제 64
• 5-2. Probe 제작 65
• 5-3. EMSA 65
• 6. ACO4 과발현체 제작 66
• 6-1. ACO4 coding sequence의 cloning 66
• 6-2. ACO4 유전자의 coding sequence의 binary vector내로 도입 66
• 6-3. Agrobacterium을 통한 식물체로의 형질전환 67
• 6-4. Agrobacterium-mediated plant transformation 67
• 6-5. 35S-ACO4 형질전환체 선별 67
• 7. Ethylene 함량 분석 67
• III. 결과 69
• 1. ACO4의 발현 양상 분석 69
• 1-1. qRT-PCR을 통한 ACO4 발현 변화 72
• 1-2. 애기장대 내 ACO4 유전자의 시공간적 발현 양상 76
• 2. BES1/BZR1의 ACO4 promoter 결합 확인 91
• 2-1. EMSA를 통한 in vitro binding 91
• 3. Ethylene 내생 함량 분석 95
• 4. BRs mutants의 ethylene에 의한 표현형 변화 관찰 97
• 5. ACO4 과발현체 표현형 분석 99
• IV. 고찰 105
• 제 4장 종합고찰 109
• 1. BRs에 의한 ABA 생합성 조절 기작 109
• 2. BRs에 의한 ethylene 생합성 조절 기작 110
• 3. 식물 호르몬의 cross talk 112
• 참고문헌 114
• 국 문 초 록 132
• Abstract 134