Fabrication and Characterization of Type I Collagen-based Scaffolds : 제1형 콜라겐 기반 지지체의 제조 및 특성분석
저자
발행사항
서울 : 연세대학교 일반대학원, 2016
학위논문사항
Thesis(doctoral)-- 연세대학교 일반대학원 : 나노과학기술협동과정 2017. 2
발행연도
2016
작성언어
영어
주제어
DDC
620.5
발행국(도시)
대한민국
형태사항
91p ; 26 cm
일반주기명
지도교수: 김현우
소장기관
콜라겐은 생체 적합성, 생분해성과 조직 및 장기 형성에 있어 중요한 낮은 면역 반응의 특성을 갖는 천연재료로 세포의 다양한 기능 발현에 관여한다. 특히, 제1형 콜라겐은 의료용으로서 적합한 재료로 알려져 있다.
본 연구에서는 제1형 콜라겐 추출을 위한 펩신-아세트산 처리에서 아세트산의 잔여가 추출된 콜라겐에 미치는 영향과 콜라겐 기반의 다공성 지지체 및 이에 부착된 세포에 미치는 영향을 확인 하였다. 또한 추출된 콜라겐을 이용하여 마이크로 섬유, 나노섬유 시트를 제작하고 이에 지방유래 줄기세포를 배양함으로서 세포 기반 지지체로서의 응용 가능성을 확인하였다.
제1형 콜라겐은 돼지의 피부로부터 추출되었다. 탈이온수로 처리한 콜라겐 (DDW)과 달리 0.5 M의 아세트산으로 처리한 콜라겐 (DAC)은 구조적 열적 특성에 있어 변성을 나타냈다. DDW와 DAC를 사용하여 제작한 지지체는 모든 농도 (0.5, 1 및 2% w/v)에서 높은 기공률을 보였으며 (>98%) 이들의 기공 형태는 동일한 농도에서 서로 유사하였다. 그러나 물리적 특성 (무게, 두께 및 부피)과 팽윤 거동에 있어 DDW와 DAC 지지체 간에 차이가 있었으며 특히, 기계적 자극에 의한 지지체의 중량 손실에 있어서 DAC 지지체는 높은 분해 거동을 보였다. 지방유래 줄기세포를 사용한 배양 실험을 통해 DDW와 DAC 지지체 내에서 중간엽 줄기세포로서의 이들의 특성이 10일 동안 변하지 않음을 확인할 수 있었으나, DAC 지지체 내에서 세포는 낮은 증식을 보였다.
콜라겐 마이크로 섬유는 에탄올-물 용매 하에서 제조되었다. 높은 에탄올 농도일 때, 섬유 표면의 형태적 균일성이 증가되고 직경은 감소하며 인장 강도는 증가하는 것으로 나타났다. 세포의 형태는 마이크로 섬유의 표면 형태에 따라 상이했으나 모든 조건 하에서 섬유 표면에 부착된 세포 수는 유사하였으며, 90 시간 동안 생존을 유지하였다.
콜라겐 기반의 전기 방사 나노섬유 시트는 상대 습도 (30% 및 60%)와 20× 인산염 완충 식염수-에탄올로 구성된 용매 (1:1, 1:1.3, 1:1.5 비)하에서 제조되었다. 낮은 습도와 높은 에탄올 함량은 나노섬유를 제조하기에 최적의 조건으로 나타났다. 콜라겐의 구조적 불안정성은 에탄올의 증가와 함께 감소하였다. 모든 나노섬유 시트는 배양 후 1주일 일 때 양호한 세포 부착을 보였으나 8주 후 상대습도가 60%일 때는 나노섬유의 분해로, 부착된 세포가 없거나 (1:1 용매) 부착 정도가 감소하였다 (1:1.3 용매).
결과를 종합해 볼 때, 세포를 안정적으로 유지하는 콜라겐 기반 지지체를 제조하기 위해서는 추출한 콜라겐 내의 산을 제거할 필요가 있을 것으로 사료된다. 또한 본 연구에서 콜라겐 기반 인공 지지체의 형태학적, 기계적 성질 및 콜라겐의 구조적 특성에 영향을 미치는 다양한 요인이 제시되었는데 그들의 독특한 특징에 따라 콜라겐 기반의 다공성 지지체, 마이크로 섬유 및 나노섬유 시트는 조직 수복 및 세포 치료 관련 응용 분야에 적용될 수 있을 것으로 기대한다.
Collagen is a natural, biocompatible and biodegradable material with low immunogenicity that is important in tissue and organ formation and is involved in multiple cellular functions. Moreover, type I collagen is known to be a suitable material for medical applications.
In this study, the influence of acetic acid residue on type I collagen isolated by pepsin-acetic acid treatment, collagen-based porous scaffolds, and seeded cells on scaffolds was confirmed. In addition, microfibers and nanofibrous sheets were fabricated with isolated collagen, and adipose-derived stem cells (ADSCs) were seeded on fabricated scaffolds to verify their application as cell-based scaffolds.
Type I collagen was isolated from porcine skin. Unlike the isolated collagen dialyzed against deionized water (DDW), collagen dialyzed against 0.5 M acetic acid (DAC) showed structural and thermal denaturation. Both DDW- and DAC-based porous scaffolds at all collagen concentrations (0.5, 1, and 2% w/v) were highly porous (>98%) and their pore morphologies were comparable at the same concentration. However, the DDW and DAC scaffolds displayed differences in their physical properties (weight, thickness, and volume) and swelling behaviors. In particular, the weight losses induced by mechanical stimulation represented a high degradation behavior of DAC scaffolds. In cell culture experiments using ADSCs, their mesenchymal stem cell (MSC) characteristics remained unchanged in both DDW and DAC scaffolds for 10 d, although cells in the DAC scaffolds were less proliferated.
The collagen microfibers were fabricated in ethanol-water solvents. As the ethanol concentration increased, the fibers exhibited increased uniformity of surface morphology, decreased diameter, and increased tensile strength. The cell morphologies on the fibers varied due to the fiber surface morphology, while the number of cells on the fiber surface was similar under all conditions, and the cells sustained their viability for 90 h.
Electrospun collagen nanofibrous sheets were fabricated at 30 and 60% relative humidity (RH) with 20× phosphate-buffered saline (PBS)-ethanol (1:1, 1:1.3, and 1:1.5 ratio). The results demonstrated that low RH and high ethanol content were the optimal conditions to produce nanofibers. The structural instability of collagen decreased with increasing ethanol content. All nanofibrous sheets showed good cell attachment at 1 week. However, because of nanofiber degradation, the cell attachment was non-existent (1:1) or reduced (1:1.3) at 60% RH at 8 weeks.
Collectively, the necessity of removing acetic acid from isolated collagen to fabricate collagen-based scaffolds for stable cell support was suggested. Also, the various factors influencing the morphological and mechanical properties of collagen-based scaffolds and the structural characteristics of collagen in those scaffolds were represented. According to their distinct characteristics, the collagen-based porous scaffolds, microfibers, and nanofibrous sheets produced in this study show potential for tissue repair- and cell therapy-related applications.
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