결장암 세포주에서 apoptosis 유도와 p53 발현 = Expression of p53 and induction of apoptosis in colon cancer cell line

국문 초록 (Abstract)

생체에는 세포의 생사를 적절히 조절하는 기작이 존재하는데 암세포에서는 이러한 균형이 이루어지지 못하고 세포가 무한 증식하는 특징을 가진다. 일반적으로 암세포에서는 apoptosis라는 programmed cell death가 일어나지 않으며, apoptosis는 어떤 특정한 유전자의 발현을 필요로 하는 능동적인 반응으로 형태학적으로는 핵내 chromatin condensation과 apoptotic body가 형성되고, 생화학적으로는 genomic DNA에 180-200bp 크기의 fragment가 형성되는 특징이 있다. 이러한 apoptosis와 관련되어 있는 가장 주요한 유전자는 p53이다. 이 유전자는 DNA손상이 일어날 경우 이를 치유하거나 세포사멸을 유도하여 암 발생을 억제한다. Cellular stress에 의해서 불활성화한 형태의 p53이 안정되면서 활성화된 형태의 p53으로 변화하면서 caspase를 통해 apoptosis를 유발하기도 하고 p53 target gene을 조절하여 apoptosis가 유발되기도 한다. 현재 보고된 바에 의하면, human cancer의 약 50%정도가 p53 변이에 의한 것이다.
본 연구는 결장암 세포주인 HCT116 cell line에서 항암제인 cisplatin과 doxorubicin을 각각 처리하거나 항산화제인 vitamin C와 curcumin을 항암제와 복합 처리하여 apoptosis 유도여부를 세포 성장분석, 투과전자현미경(TEM)을 이용한 형태학적인 분석, DNA 단편 분석, Flow cytometry에 의한 cell cycle 분석 등으로 조사하고, 이와 관련된 p53의 발현정도를 western blotting으로 측정하였다. 결장암세포주 HCT116은 항암제 cisplatinrhk doxorubicin에 의해 apoptosis와 p53 발현이 유도됨으로서 서로 밀접한 관계가 있는 것으로 보이며, 항산화제인 vitamin C는 cisplatin과 doxorubicin에 의한 세포독성 및 p53 발현을 증가시킨 반면 curcumin은 항암제의 독성을 다소 억제하였고, p53 발현 역시 억제시키는 것으로 나타났다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The p53 tumor suppressor gene is inactivated in the majority of human cancers. p53 is mediates either apoptosis or cell cycle arrest in response DNA damage. Thus. abnormal cells are suffered shether death or proliferation. The aim of this study was to determine shether apoptosis is dependent on the p53 induction in human colon cancer cell(HCT116), also anticancer drugs and antioxdants are correlated with expression of p53 and induction of apoptosis. First of all, to exam the effect of apoptosis of HCT116 cell line. HCT116 cell line was treated with cisplatin(CDDP), doxorubicin(DXR), vitamin C(VC) or curcumin(CMN) for 24 hours and estimated for effects of cell viability, cell morphology, DNA fragmentation, cell cycle analysis(flow cytometry). Then, to exam the correlation with p53, we performed following western blot analysis by using p53 primary antibody. The result showed supression of cell viability, with dose-dependent manners. VC slightly suppressed HCT116 cell growth but, CMN was tendency to opposition. Electrophoretic analysis of total cellular DNA revealed the pattern of internucleosomal DNA cleavage, which is specific for apoptosis and the effect was observed from 1㎏/㎖, 10㎏/㎖ DXR and CDDP treatments. Morphological changes such as apoptotic body, membrane blebbing, and chromatin condensation were observed in DXR and CDDP treated HCT116 cells. These results demonstrate apoptosis induced by CDDP and DXR. Western blot analysis showed that p53 protein level was markedly induced in HCT116 cells after anticancer drugs. CDDP and DXR treatment. Therefore, induction of apoptosis was associated with expression of p53. VC enhanced the cytotoxic effect of anticancer drugs(CDDP and DXR) and induced upregulation of p53. However. CMN inhibited cytotoxic effect of anticancer drugs and downregulated p53 expression. These results suggest that enhanced p53 espression by VC may have therapeutic application in increasing the efficiency of chemotherapy in colon cancers.

목차 (Table of Contents)

• 목차
• 약어기호표 = i
• 국문요약 = ii
• I. 서론 = 1
• II. 재료 및 방법 = 7
• 1. 세포주 = 7
• 2. 시약 = 7
• 3. 세포배양 = 8
• 4. 세포성장 분석 = 8
• 5. 형태학적 분석 = 8
• 6. DNA 단편화 분석 = 9
• 7. Westeun blot 분석 = 10
• 8. Flow cytometer를 이용한 cell cycle 분석 = 11
• III. 결과 = 12
• 1. Cisplatin과 doxorubicin이 HCT116 세포주의 성장에 미치는 영향 = 12
• 2. Cisplatin과 doxorubicin에 의한 형태학적 변화 = 13
• 3. Cisplatin과 doxorubicin 처리에 따른 DNA 단편화 분석 = 21
• 4. Cisplatin과 doxorubicin 처리에 따른 flow cytometry 분석 = 23
• 5. Cisplatin과 doxorubicin 처리시 HCT116 세포주의 p53 발현 = 23
• IV. 고찰 = 31
• 참고문헌 = 34
• Abstract = 43