Development of small molecules that target the novel alternative functions of glycolytic enzymes to treat cancer and diabetes = 해당과정 효소를 표적으로 하여 해당과정 및 새로운 기능 억제를 통한 항암, 항당뇨 치료약물의 개발

국문 초록 (Abstract)

현대 사회에서 인간의 수명은 꾸준히 증가하고 있다. 항생제의 등장이 이를 크게 증진 시켰고, 제약산업이 그 뒤를 이어 나가고 있다. 여러 질환을 치료하는 제약연구 중 가장 활발하게 연구가 이루어지는 분야는 암과 당뇨이다. 당뇨병과 암은 높은 수준의 연구가 이루어졌음에도 불구하고 아직까지 완치 약은 없다. 이러한 면을 보완 하기 위해서는 질병의 본질적 연구와 함께 질병과 연관된 새로운 세포 내 표적 단백질의 발굴이 필요하다. 본 연구는 암세포의 중요한 특징 중의 하나인 ‘항진된 해당과정’에 집중하고 있다. 산소가 충분한 상태에서도 암세포가 해당과정을 주요 에너지 공급과정으로 사용한다는 점은 항암 표적으로서의 높은 가능성을 시사하기 때문이다.
파트 1에서는 해당과정 효소인 에놀레이즈 （enolase）의 신규 저해제인 저분자 화합물 ENOblock의 개발과 이 화합물의 항암 및 항당뇨 효과, 그리고 작용기작 규명에 관한 내용을 담고 있다. ENOblock은 암조직의 일반적 환경인 혐기 상태에서 암세포를 억제하는 물질을 선별하는 스크리닝 시스템을 이용하여 발견되었다. ENOblock은 혐기성 환경에서 암세포의 성장을 억제하였으며, pull-down assay를 통해 ENOblock의 세포 내 결합 단백질로서 해당과정 효소인 에놀레이즈를 규명하였다. 또한, ENOblock은 제브라피쉬 배아를 이용한 in vivo assay에서도 항암 효과를 나타냈었다. 그런데, 흥미롭게도 ENOblock은 선행 연구에서 세포 내 포도당 흡수를 촉진하는 물질로서 선별되었었다. 본 연구에서는 세포-기반 in vitro 실험 및 제브라피쉬 in vivo 모델을 이용하여 당뇨 치료제로서의 효과를 확인하였고, 포도당 신생과정에 관여하는 PEPCK를 억제함으로써 효과를 나타낸다는 것을 규명하였다. 또한, ENOblock이 지방세포 형성 과정을 촉진하지 않아 당뇨치료제 부작용인 비만을 일으키지 않음을 확인하였다. 더불어, 지방세포 형성 과정과 비슷한 대식세포의 거품세포 형성을 억제하여 당뇨 합병증인 동맥경화에도 효과가 있음을 규명하였다.
파트 2는 저분자 화합물인 GAPDS의 항암 효과와 작용 기전 규명에 관한 내용을 담고 있다. 선행 연구에서 GAPDS는 해당과정 효소 GAPDH tetramer를 monomer로 쪼개는 약물로 알려졌다. 이는 세포내의 PIP2 및 PIP3의 양을 늘리고, insulin 회로를 작동시켜 당뇨 치료제 효과를 보였다. 본 연구에서는 GAPDS의 항암 효과를 GAPDH 억제제 6-OHDA와 비교 분석 하였다. 단순히 GAPDH와 결합해 효소능을 억제하는 6-OHDA와는 다르게 GADPS는 세포내 GAPDH양을 줄이고 tubulin의 합성을 억제했다. 대장암 세포에 GAPDS를 처리하여 세포 주기가 G2/M기에서 멈춤을 확인하였다. 줄어든 tubulin은 세포 이동에 관련된 actin의 형성에 관여하여, 암세포의 이동능력을 효과적으로 억제하였다. 이는 암세포의 침윤, 전이, 및 wound healing assay를 통해 확인하였고, actin을 phalloidin으로 염색하여 actin이 정상적으로 형성되지 않음을 보였다. 이런 항암효과는 제브라피쉬 암세포 주사 모델 및 마우스 암세포 동종이식 모델에서도 확인 되어 in vivo에서도 효능을 보임을 입증하였다.
부록은 저분자 물질 조합만으로 분화 완료된 근 섬유를 지방, 조골, 신경세포로 유도한 연구 내용을 담고 있다. 현재, 대다수의 줄기세포 연구는 Yamanaka factor로 알려진 유전자들을 세포에 도입하는 방식으로 이루어 지고 있다. 이 방법은 유전자의 정량적 도입이 힘들고, 높은 수율의 유전자 도입을 위해 바이러스를 사용한다는 점 등이 문제가 된다. 하지만 제어가 쉬운 저분자 물질을 사용하면 농도를 조절하기 쉽고, 완성된 시스템을 어디서라도 바로 상용화 시킬 수 있다는 장점이 있다. 부록의 저분자 물질을 사용한 줄기세포 연구는 양서류의 사지 재생과정과 매우 유사한 과정을 따라 이루어 졌다. 저분자 물질만으로 다핵세포인 근섬유를 단핵세포로 쪼개고, 분화능을 부여한 후, 유도약물을 이용하여 지방세포, 조골세포 및 신경세포로 성공적으로 분화시켰다. 그 중 저분자 물질 BIO（6-Bromoindirubin-3'-oxime）는 가장 뛰어난 효과를 보였다.
결론적으로, 해당과정 효소인 에놀레이즈와 GAPDH를 각각 표적으로 하는 저분자 물질 ENOblock과 GAPDS는, 차세대 항당뇨 치료제는 물론 항암 치료제 개발의 유망한 후보 약물로 사료된다. 또한, 에놀레이즈를 신규 항당뇨 표적으로서 제시하였으며, GAPDH가 세포 내 tubulin 양 조절에 관여함을 밝혀 GAPDH의 새로운 기능을 규명하였다. 추가적으로, 부록에 포함된 연구를 통해, 저분자 물질 조합만으로 완전히 분화된 근섬유를 탈분화시키고 다시 지방, 조골, 및 신경세포로 재분화시킬 수 있음을 증명하였다. 이는, 안전하고 효율성이 높은 방법으로 치료용 세포를 생산하여 치료 난치성 질환을 치료 할 수 있는 새로운 기반을 마련한 연구로 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Human life span is increasing in modern society. Antibiotics were a major factor for this increase and, more recently, advances in drug discovery are an additional contributing factor. The major focuses of drug discovery are cancer and diabetes. Despite of profound research about cancer and diabetes for several decade, there are no complete recovery drug. Discovery and development new drugs that targeting new cellular protein will be helpful to cure cancer and diabetes. This thesis is focused glycolysis in cancer cells. Glycolysis is highly upregulated in cancer cells. Cancer cells use glycolysis mainly to get energy even they can use oxygen normally. These phenomena represent that glycolysis enzyme can be a good target for cancer therapy. Part I is covering the discovery of the small molecule “ENOblock” that first directly bind enolase and inhibit its activity. Drug screening system that can select anti-cancer drug under the hypoxia that common cancer environment was used. Glycolytic enzyme enolase targeting ENOblock successfully inhibit cancer cell invasion and viability under hypoxia and also in zebrafish in vivo system. Interestingly, our lab previously reported that ENOblock has anti-diabetic effect. I confirmed its anti-diabetic effect on zebrafish in vivo model and found out gluconeogenesis enzyme PEPCK is reduced when ENOblock treated. Also, I showed adipogenesis, the side effect of anti-diabetic drug, is significantly decreased when ENOblock was treated. Similarly the foam cell formation, lipid accumulated macrophage differentiation, was inhibited by ENOblock treatment. Foam cell formation is known for the first step of atherosclerosis. It suggest that ENOblock can reduce diabetes complication, In part II, I researched the small molecule “GAPDS”. GAPDS was previously reported that segregating GAPDH and increasing PIP2 and PIP3 cellular level. It stimulates insulin pathway and showed anti-diabetic effect. I studied GAPDS anti-cancer effect compared to 6-OHDA, small molecule that inhibit GAPDH enzymatic activity but not segregate. GAPDS treatment break GAPDH tertiary structure and reduce GAPDH protein level in cancer cells but not mRNA level. Interestingly, reduced GAPDH level also reduced tubulin protein level. GAPDH related tubulin decrease was confirmed by siRNA mediated GAPDH inhibition. Decreased cytosolic GAPDH caused tubulin decrease and also increase nuclear GAPDH. These complex effects showed anti-cancer effect. GAPDS treated cancer cells stuck at G2/M phase and significantly decreased cell motility and increased apoptotic gene expression. Disturbed actin formation by tubulin inhibition also checked through fluorescence conjugated phalloidin staining. These drug effects were identified at in vivo model; zebrafish larvae cancer xenograft model and mouse syngeneic cancer graft model. Additionally I researched chemically induced stem cell that considered as a most powerful biopharmaceutical drug for incurable disease. Many scientist groups have researched about method to make stem cells or convert cells to different types. The major way to research stem cell is cellular introduction of Yamanaka factor. This way is powerful but have some problem. Gene introduction method is hard to inject equal amount of gene to cells and use virus for vector. However, small molecules is easy to control to nM range, stable, and also can commercialize easly. I described small molecules and method that recapitulate the early steps of urodele amphibian limb regeneration and confer multipotency. BIO（6-Bromoindirubin-3'-oxime） can give multipotency to cellularized myotube. BIO treated cellularized single myotube can proliferate and differentiate to different cell types via small molecule cocktail. Differentiated cell types （adipocytes, osteoblasts, neurons） were confirmed by showing their specific characters and gene expression. Through this thesis I showed the discovery of novel drugs, drug targets and their therapeutic potential for treating cancer, diabetes, and degenerative disease.