Anti-allergic inflammatory effects of probiotics in RAW264.7 macrophages and atopic dermatitis animal models

국문 초록 (Abstract)

연구 배경 및 목적; 다인성의 만성 염증성 피부 질환인 아토피 피부염은 극심한 가려움증, 피부 장벽의 손상, 염증, 건조증, 홍반 및 부종을 특징으로 하며, 수면부족 및 심리적 고통을 야기하여 삶의 질을 떨어뜨린다. 아토피 피부염의 치료를 위해서 국소스테로이드, 항히스타민과 같은 면역 억제제가 주로 사용되지만, 이는 구토, 설사 및 피부 가늘어짐과 같은 많은 부작용을 초래한다. 프로바이오틱스는 숙주 건강상의 이점을 제공하는 살아있는 미생물로 이미 많은 연구에서 프로바이오틱스가 알레르기 완화 효과를 가지고 있음이 드러났지만, 프로바이오틱스의 면역반응 조절 메커니즘은 여전히 불분명하다. 따라서, 본 연구에서는 프로바이오틱스 혼합물인 Probiotics mixture의 아토피 피부염 동물 모델과 RAW264.7 대식세포에서의 항아토피 염증 효과와 그 기전을 규명하고자 한다.
재료 및 방법; Probiotics mixture는 L. casei CBT LC5 (KCTC12398BP), L. plantarum CBT LP3 (KCTC10782BP), L. rhamnosus CBT LR5 (KCTC12202BP), and B. lactis CBT BL3 (KCTC11904BP)로 구성되어있다. RAW264.7 대식세포에서 MTT assay를 통해 세포 독성을 측정하였으며, 세포 상층액을 이용하여 산화질소 및 사이토카인 생성량을 측정하였다. real-time PCR을 통해 iNOS 및 사이토카인의 mRNA 발현량을 측정하였으며, 전사인자의 발현은 western blot을 통해 확인하였다. 더욱이, 아토피 피부염 유도 마우스 모델을 제작하여 아토피 피부염의 증상을 육안으로 관측하고, 조직으로부터 H&E 및 TUNEL 염색을 통해 염증세포의 침윤 및 세포사멸을 측정하였다. 더욱이, 마우스의 혈액으로부터 PBMCs를 분리하여 real-time PCR과 western blot으로 T 세포 연관 사이토카인 및 전사인자의 발현을 측정하였다.
결과; Probiotics mixture는 LPS로 자극된 RAW264.7 대식세포에서 산화질소 생성을 억제하였으며, IL-6, IL-10 및 IL-12p40과 같은 항염증성 사이토카인 발현을 유도하였다. 이는 STAT 1/3, MAPKs (p38, JNK)의 인산화 및 NF-κB의 활성에 의해 나타났다. 아토피 피부염 유도 마우스 모델에서 가려움증, 홍반, 피부 침식, 부종 및 면역세포의 침윤 등과 같은 아토피 피부염의 증상이 Probiotics mixture의 투여로 상당히 개선됨을 확인하였다. 실험 동물의 혈액으로부터 PBMCs를 분리하여 T 세포 연관 사이토카인 및 전사인자의 발현을 분석 한 결과, Probiotics mixture는 AD 유도에 의해 증가된 Th2 연관 사이토카인인 IL-4, -5 및 IL-17의 발현 및 c-Maf, GATA3와 같은 전사인자의 발현을 억제시켰다. 반면, Th1 연관 사이토카인인 IL-2, IFN-γ 및 IL-10 및 T-bet, STAT1/4와 같은 전사인자의 발현을 유의하게 증가시켰다.
결론; 본 연구를 통해 Probiotics mixture가 염증 및 아토피 피부염에 개선효과가 있음을 확인하였고, 이는 아토피 피부염의 치료제로서 잠재적 가능성이 있음을 보여준다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Background and Objective; Atopic dermatitis (AD) is a multifactor chronic inflammatory skin disease that has excessive itching, skin barrier damage, inflammation, dryness, erythema and edema, and causes sleep disorders and psychological distress, leading to lower quality of life. Immune-suppressants such as topical steroids, antihistamines and emollients are used for the treatment of AD, but there is a risk of side effects such as vomiting, diarrhea and skin thinning. Therefore, new materials such as plants and probiotics are required in recent years as safe and long-term treatment strategies. Probiotics are living microorganisms that provide health benefits to the host. Already, many studies have demonstrated a specific probiotics role in the prevention and treatment of allergies, but the exact mechanism by which probiotics regulate the immune response is not clear. Therefore, this study aimed to evaluate the immunomodulatory effects of probiotics mixture Probiotics mixture on anti-inflammatory and anti-atopic dermatitis in vitro and in vivo.
Materials and Methods; The probiotics mixture is consisted of Lacobacillus casei CBT LC5 (KCTC12398BP), Lacobacillus plantarum CBT LP3 (KCTC10782BP), Lacobacillus rhamnosus CBT LR5 (KCTC12202BP), and Bifidobacterium lactis CBT BL3 (KCTC11904BP). Cytotoxicity was measured by cell viability assay. the product of Nitric oxide (NO) and cytokine was analyzed used cell culture supernatant. The expression level of anti-inflammatory cytokines and T cell-associated cytokines was measured by real-time PCR, and the expression of transcription factors was measured by western blot in RAW264.7 macrophage and peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). Symptoms of AD were investigated used house dust mite (HDM) extract-induced atopic dermatitis-like mouse model. Also, H&E staining and TUNEL staining was performed for the histological analysis.
Results; Probiotics mixture regulates the production of NO and anti-inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-6, IL-10, and IL-12p40 to regulate the inflammatory response. Anti-inflammatory activity of Probiotics mixture was caused by phosphorylation of Signal transducer and activator of transcription (STAT) 1/3 and activation of nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF-κB). Moreover, Probiotics mixture significantly improved the symptoms of AD, histologic score and serum immunoglobulin(Ig) E in AD-like mouse models. Probiotics mixture induced upregulation of T-bet and STAT 1/4 as well as increased IFN-γ and IL-2, indicating that it induces Th 1 response. On the other hand, Probiotics mixture showed inhibition of Th2 response through downregulation of GATA-3, c-Maf and inhibition of IL-4, IL-5 and IL-17 expression.

목차 (Table of Contents)

• Introduction 1
• Materials and methods 6
• 1. Probiotics 6
• 2. Cell Culture and Stimulation 6
• 3. Measurement of Cell Viability Assay 6
• 4. Measurement of NO Production 7
• 5. Measurement of Cytokine Production 7
• 6. Real-time PCR Analysis 8
• 7. Western Blot Analysis 10
• 8. Animals 10
• 9. Design of Experimental AD Model 10
• 10. Measurement of Ear Thickness and Spleen Weight 11
• 11. Measurement of Total Serum IgE 11
• 12. Histology 11
• 13. PBMCs Isolation 12
• 14. Statistical Analysis 12
• Results 14
• 1. Effects of Probiotics Mixture on Cell Viability in RAW264.7 Macrophage 14
• 2. Effects of Probiotics Mixture on NO Production in RAW264.7 Macrophage 14
• 3. Effects of Probiotics Mixture on Anti-inflammatory Cytokine Production in RAW264.7 Macrophage 15
• 4. Effects of Probiotics Mixture on Phosphorylation of MAPKs in RAW264.7 Macrophage 16
• 5. Effects of Probiotics Mixture on Phosphorylation of STAT 1/3 in RAW264.7 Macrophage 16
• 6. Effects of Probiotics Mixture on NF-κB Activation in RAW264.7 Macrophage 17
• 7. Effects of Probiotics Mixture on AD-like Symptoms 17
• 8. Effects of Probiotics Mixture on Histological Change 18
• 9. Effects of Probiotics Mixture on Cytokine mRNA Expression 19
• 10. Effects of Probiotics Mixture on Expression of Transcription Factors 20
• Discussion 49
• References 56
• Abstract (In Korean) 68