Functional Mechanism of an NADH Oxidase from Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus Based on Structural Analysis

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

NADH oxidase (NOX) is a member of the flavoprotein disulfide reductase family which catalyzes the pyridine-nucleotide-dependent reduction of various substrates including molecular oxygen, hydrogen peroxide and thioredoxin. The physiological role of NOX is diverse depending on its substrates and products in different organisms. In anaerobic mesophiles, NOXs, such as those of Clostridium aminovalericum, Enterococcus and Lactococcus, are considered to be important enzymes in detoxifying oxidative stress and in regenerating oxidized pyridine nucleotides through their capacity to reduce oxygen to water without the formation of harmful reactive oxygen species. An NADH oxidase was cloned from the genome of Thermococcus profundus (NOXtp) by genome walking and the encoded protein was purified to homogeneity after expression in Escherichia coli. Subsequent analyses showed that it is a FAD-containing protein with a subunit molecular mass of 49 kDa that exists as a hexamer with a native molecular mass of 300 kDa. A ring-shaped hexameric form was revealed by electron microscopic and image processing analyses. NOXtp catalyzed the oxidization of NADH and NADPH and predominantly converted oxygen to H2O, but not to H2O2 as in the case of most other NADH oxidases. To our knowledge, this is the first example of a NOX that can produce H2O predominantly in a thermophilic organism. As an enzyme with two cysteine residues, NOXtp contains a cysteinyl redox center at Cys45 in addition to FAD. Mutant analysis suggests that Cys45 in NOXtp plays a key role in the four electron reduction of O2 to H2O, but not in the two electron reduction of O2 to H2O2. As genome of Thermococcus kodakarensis KOD1 has been sequenced and it is convenient to clone gene and identify protein from T. kodakarensis KOD1, NOX from T. kodakarensis KOD1 (NOXtk) was used to study NOX function in vivo. NOXtk shows 90% identity to NOXtp, and it displays two forms: dimer under normal conditions and hexameric under oxidized condition by H O treatment. An ATP/NAD kinase was identified to bind NOX by 6×his-NOX pull down assay. The ATP/NAD kinase can only bind to oxidized hexameric NOXtk by far western blotting, pull-down and gel filtration chromatography assays. ATP/NAD kinase can catalyze phosphorylation of NADH to NADPH by ATP; and NOXtk can restrain its activity by its hexameric form but not dimmeric form. As NAD(H) and NADP(H) have different roles in vivo, we propose a model for the two proteins function.
Because NOX’s thermophilic and mesophilic homologs, such as NADH oxidase from Thermus thermophilus and Lactobacillus sanfranciscensis, are generally dimeric, we examined whether NOXtp, which is from an anaerobic thermophilic organism, assumes different structures under different conditions. In this report, we show that NOXtp displays two forms: a native dimeric protein under physiological conditions and an oxidized hexameric form under oxidative stress. Native NOXtp displays high NADH oxidase activity, and oxidized NOXtp can accelerate the aggregation of partially unfolded proteins. The aggregates formed by NOXtp have characteristics similar to β-amyloid and Lewy bodies in neurodegenerative diseases, including an increase of β-sheet content. Oxidized NOXtp can also bind nucleic acids and cause their degradation by oxidizing NADH to produce H2O2. Furthermore, Escherichiacoli cells expressing NOXtp are less viable than cells not expressing NOXtp after treatment with H2O2, indicating that NOXtp can accelerate oxidatively triggered cell death. To our knowledge, this is the first known archaeal protein with cell death activity similar to eukaryotic isozymes. As life may have originated from hyperthermophiles, NOXtp may be an ancestor of cell death proteins.

국문 초록 (Abstract)

NADH 산화효소 (NOX)는 flavoprotein disulfide 환원 효소 family에 속하고 산소분자, 과산화 수소, thioredoxin을 포함하는 여러 기질을 pyridine-nucleotide를 통해 환원 시키는 촉매 작용을 한다. NOX의 생리학적인 특성은 기질이나 부산물에 따라 다양한데, 혐기성 중온균인 Clostridium aminovalericum, enterococcus그리고 Lacococcus의 NOX는 유해한 활성산소의 형성없이 산소에서 물로 변환하는 능력을 통해서 산화된 pyridine nucleotide의 환원과 oxidative stress의 독성 제거에 중요한 역할을 한다. 초고온 생명체인 Thermococcus profundus의 genome으로부터 NADH 산화효소(NOXtp)를 clone 하였고 대장균에서 발현 시킨 뒤 분리 정제 하였다. 이 단백질은 FAD를 포함하며 subunit의 분자량은 약 49 kDa 이고, native 상태에서는 약 300 kDa의 분자량을 나타내다. 전자 현미경과 image processing 기법을 이용하여 NOXtp는 hexameric ring-shaped 구조임을 밝혔다. 또한 gel filtration과 non-denaturing gel등을 통해서 NOXtp는 49 kDa의 subunit이 6개로 구성된 hexamer 구조임을 밝혔다. NOXtp는 NADH 뿐만 아니라 NADPH의 산화를 촉진하고 산소를 물로 변화 시키는 역할을 수행함을 알 수 있다. 그러나, 다른 대부분의 NADH 산화효소처럼 H2O2로 바꾸지는 못한다. NOXtp는 두 개의 cysteine Cys45, Cys122 잔기를 가지고 있으며 Cys45 와 FAD위치에 redox active center를 가진다. Mutant 분석을 통해서 NOXtp의 Cys45가 산소에서 물로 바꾸는 환원반응에서 중요한 역할을 하지만 과산화 수소로 바꾸는 2개의 전자 환원반응에서는 그렇지 않음을 밝혔다. 이러한 사실을 바탕으로 우리는NOX가 고온 생명체에서 물을 생성하는 최초의 예시임을 보여준다. 다음으로NOX의in vivo 기능을 연구하기 위해 초고온 생명체인 Thermococcus kodakarensis KOD1의 NADH 산화효소(NOXtk)을 cloning하고 단백질을 순수분리 하였다. NOXtk의 아미노산 서열은 NOXtp와 90%의 높은 동일성을 보여 준다. 또한NOXtk는 생리적인 조건에 따라서 두 가지 다른 구조를 가지고 있다. 즉, 정상적인 조건하에서는 dimmer 구조로 존재하고 H2O￢2의 처리로 인한 산화조건하에서는 hexameric 구조로 존재함을 밝혔다. ATP/NAD kinase가 6×his-NOX pull down assay를 통해 NOX와 결합하는 것을 확인 했다. Far western blotting, pull-down 그리고 gel filtration chromatography assays로부터 ATP/NAD kinase는 산화된 hexameric NOXtk와는 결합 하지만 dimeric NOXtk와는 결합 하지 않음을 알 수 있었다. ATP/NAD kinase는 ATP를 이용해서 NADH로 부터 NADPH로의 인산화 과정을 촉진시킬 수 있고, NOXtk는 hexameric 구조 일때 ATP/NAD kinase 활성을 억제할 수 있지만 dimmeric구조 일때는 억제할 수 없다. NAD(H) 와 NADP(H)는 생체 내에서 다른 역할을 나타내므로 우리는 두 단백질의 기능에 대한 모델을 제안했다.
NOXtp는 thermophilic과 mesophilic 생명체 NOX의 아미노산 서열에 높은homology를 가지고 있으며, 이들은 일반적으로 dimeric 구조를 가지고 있기 때문에, 우리는 NOXtp가 산소에 노출 되었을 때와 되지 않았을 때 (physiological condition)의 어떤 구조적 변화가 있는지를 고찰 하였다. NOXtp가 조건에 따라 다른 두 가지의 구조를 가지고 있음을 알 수 있었다. 즉, 생리적인 조건하에서는 dimeric 구조를 나타내고, 산화 스트레스 조건하에서는 hexameric 구조를 가지고 있음을 알 수 있었다. Native NOXtp는 높은 NADH 산화효소의 활성을 나타내고, 산화된 NOXtp는 부분적으로 unfolding된 단백질의 형성을 증가 시킴을 알 수 있었다. 또한 NOXtp에 의해 형성된 aggregates는 β-sheet가 증가 되는 신경조직퇴화 질병에서 β-amyloid 와 Lewy bodies와 유사한 특징을 가지고 있음을 알 수 있었다. 산화된 NOXtp는 핵산과 결합할 수 있고, H2O2를 생산하는 산화된 NADH에 의해 핵산은 분해 됨을 알 수 있었다. 더 나아가서 과산화 수소를 처리한 NOXtp를 발현하는 E.coli는 NOXtp가 발현 되지 않은 E.coli 보다 약한 생존능력을 보여주었다. 이것은 NOXtp가 산화에 의해 발생하는 세포사멸을 촉진한다는 것을 나타내고 있다. 이와같은 결과는 NOXtp는 진핵생물의 isozymes과 유사한 cell death 활성을 가지는 고세균 단백질임을 처음으로 밝혔다. 예를 들면 생명이 초호열성 생물에서 기원 되었을지도 모르는 것처럼, NOXtp는 아마도 최초의 cell death 단백질 일지도 모른다.

목차 (Table of Contents)

• Part Ⅰ: Hexameric ring structure of a thermophilic archaeon NADH oxidase that produces H2O and inhibits a kinase activity = 1
• Ⅰ. Introduction = 2
• Ⅱ. Materials and Methods = 5
• Ⅲ. Results = 15
• 1. Cloning and sequencing of the nox gene from T. profundus = 15
• 2. Purification of the native and recombinant NOXtp protein = 19
• 3. Structure of NOXtp = 22
• 4. NOXtp is a FAD-dependent NADH and NADPH oxidase = 26
• 5. NOXtp preferentially produces H2O = 32
• 6. Cys45 but not Cys122 functions as the nonflavin redox center = 33
• 7. NOXtk could bind to ANKtk in its oxidized form = 39
• 8. Effect of NOXtk on the activity of ANKtk = 50
• Ⅳ. Discussion = 52
• Ⅴ. References = 56
• Part Ⅱ: An archaeal protein switches from an NADH oxidase to a novel eukaryotic-like cell death function under oxidative stress = 65
• Ⅰ. Introduction = 66
• Ⅱ. Materials and Methods = 68
• Ⅲ. Results = 75
• 1. Conformational change of NOXtp induced by stress = 75
• 2. Conformational change of NOXtp accompanies a functional switch = 79
• 3. Mechanism of oxidized NOXtp?induced protein aggregation = 84
• 4. Oxidized NOXtp damages DNA and RNA = 90
• 5. NOXtp promotes H2O2-induced bacterial cell death = 95
• Ⅳ. Discussion = 97
• Ⅴ. References = 100
• ACKNOWLEDGEMENTS = 106