허혈성 신경손상기전 연구를 위한 기관형적 해마조직절편배양 인공 허혈모델 = Artificial Ischemia Model Using Organotypic Hippocampal Slice Culture for the Study of the Mechanisms of Ischemic Neuronal Injury
연구목적: 허혈성 신경손상의 연구에 있어서 유용한 방법으로서 쥐의 뇌 해마 조직을 잘라내어 얇은 조직 절편을 만들어 배양하고 인공적으로 저산소 상태를 만들어서 허혈성 신경손상의 연구에 사용 가능한 모델을 만들고자 하였다.
대상 및 방법: 생후 4-7일 된 쥐의 뇌에서 해마를 제거하고 조직절단기를 이용하여 400-500㎛정도 두께의 횡절편을 만든다. 이 절편을 투명한 계면막에 옮긴 뒤 배양액 내에서 36.5℃, 90-100% 습도, 5% CO₂의 조건하에서 약 2주간 배양한다. 배양 온도를 철저히 유지하면서 조직절편을 무산소방에 약 35분간 넣고 현미경을 이용하여 해마의 CA1 부위의 신경세포 손상의 정도를 관찰한다. propidium iodide를 함유한 배양액내에서 48시간 배양 후 조직편의 손상 정도를 도립형광현미경으로 관찰하면서 영상으로 컴퓨터에 저장한다. 조직을 무산소방내에 약 3시간정도 넣어 해마의 CA1 부위에 100%의 손상을 만들고 그 영상을 저장한다. 3시간 무산소처리후의 영상과 초기 영상을 비교하여 손상의 정도를 결정한다.
결과: 어린 쥐의 기관형적 해마조직절편배양은 저자들이 사용한 조건하에서 2주 이상 안정되게 유지되었으며, 무산소방에서 약 35분 정도 처리함으로써 해마의 CA1 부위에 40-70%의 일관성 있는 신경세포 손상을 유발할 수 있었다. 그리고 propidium iodide를 이용한 형광강도를 영상분석 소프트웨어를 이용하여 비교측정함으로써 신경세포손상의 정도를 정량적으로 측정할 수 있었다.
결론: 상기 방법을 사용하여 허혈성 신경손상의 기전연구에 유용한 모델을 만들 수 있었는데 생체모델과 달리 다양한 생리적 변수를 조절할 수 있고, 해마내의 신경세포간 연결이 유지되어 있는 아주 우수한 관내 실험방법으로 생각된다.
Purpose: The authors tried to make useful in vitro artificial ischemia model using organotypic cultures of the rat hippocampus and anoxic chamber for the study of the mechanisms of ischemic neuronal injury.
Materials and Methods: Hippocampal slices were prepared from 4 to 7 day old neonatal Sprague-Dawley rats by removing the brain, dissecting the hippocampal formation and making transverse slices(400-500 ㎛) using a tissue slicer. Individual slices were transferred onto the transparent Acocell interface membranes with the growth medium and grown at 36.5℃ in atmosphere with 90 to 100% humidity and 5% CO2 for 2 weeks. The cultures were transferred into an anoxic chamber at 36.5℃ for 35 minutes. The first imaging of the cultures, following the ischemic insult, was done after 48 hours of incubation with
propidium iodide. Forty eight hours after the initial ischemic insult, the remaining neurons were killed by exposing the cultures to 3 hours of anoxia. The fluorescent intensity associated with 100% damage to CA1 was then determined and compared to the fluorescent intensity following the original ischemic insult.
Results: We could make excellent organotypic hippocampal slice cultures which were stable over 2 weeks. Thirty five minutes artificial ischemic insult in the anoxic chamber resulted in 40 to 70% neuronal death in the CA1 of the rat hippocampal slice cultures. The amount of neuronal death was quantified by measuring the propidium iodide fluorescent intensity with the aid of image analysis software.
Conclusion: Artificial ischemia model using organotypic cultures of the rat hippocampus was excellent in vitro technique which had retained much of the anatomy, synaptic circuitry as the intact hippocampus, and had eliminated some of the confounding physiologic variables. And this model must be a very important tool for the study of the mechanisms of ischemic neuronal injury.
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