생물학적 인 제거 슬러지 내 Accumulibacter와 Competibacter의 다양성 및 대사적 특성 연구

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Understanding genetical and physiological properties of major microorganisms involved in enhanced biological phosphorus removal (EBPR) process is important for stable operation of EBPR systems, but it have been hampered by lack of a available techniques to isolate or to identify these bacteria which are representive nonculturable bacteria.
To investigate the fine-scale diversity of polyphosphate accumulating organisms (PAO) named “Candidatus Accumulibacter phosphatis” (henceforth referred to as Accumulibacter), two lab-scale sequencing batch reactors (SBR) for EBPR were operated with sodium acetate as the sole carbon source. During SBR operations, activated sludge always contained morphologically different Accumulibacter showing typical EBPR performance, as confirmed by the combined technique of fluorescence in situ hybridization (FISH)-microautoradiography (MAR). Phylogenetic analyses together with sequences from Genbank showed that Accumulibacter 16S rRNA genes of the EBPR sludge were clearly differentiated into four Accumulibacter clades, Acc-SG1, Acc-SG2, Acc-SG3, and Acc-SG4. Specific FISH probes, Acc444, Acc184, Acc72, and Acc119, targeting these clades and some helpers and competitors were designed using the ARB program. Microbial characterization with FISH analysis using specific FISH probes also clearly indicated the presence of different cell Accumulibacter morphotypes. Subsequently, cells targeted by each FISH probe were sorted by a flow cytometer and their polyphosphate kinase 1 (ppk1) gene homologs were amplified using a ppk1 specific PCR primer set of Accumulibacter. The phylogenetic tree based on sequences of the ppk1 gene homologs was basically congruent with that of the 16S rRNA genes, but members of Acc-SG3 with distinct morphology comprised two different ppk1 genes.
Based on 16S rRNA gene sequences, new members sequences, new members of uncultured gammaproteobacterial GAO (GB) were identified from sludge samples of a lab-scale sequencing batch reactor (SBR) used for EBPR. The new GB formed a clearly distinct phylogenetic lineage (GB8) from the previously reported seven GB subgroups. Because the new GB8 members were not targeted by the known fluorescence in situ hybridization (FISH) oligonucleotide probes, a GB8-specific FISH probe (GB429) and a new FISH probe (GB742) targeting all eight GB subgroups were designed, and the phenotypic properties of the new GB8 members were investigated. FISH and microautoradiography (MAR) approaches showed that GB429-targeted cells (GB8) were large coccobacilli (2-4 µm in size) with abilities to uptake acetate under anaerobic conditions, but that were not able to accumulate polyphosphate under the subsequent aerobic conditions, consistent with in situ phenotypes of GB. FISH analyses on several sludge samples showed that members of GB8 were commonly detected as the majority of GB in lab- and full-scale EBPR processes.
To characterize denitrifying P-uptake properties of Accumulibacter, a sequencing batch reactor (SBR) was operated with acetate as the sole carbon source. The SBR operation was gradually acclimated from anaerobic-oxic (AO) to anaerobic-anoxic-oxic (A2O) conditions by the stepwise increase of nitrate concentration and anoxic time. The communities of Accumulibacter and flanking bacteria at the AO (stage 1) and A2O (stage 5) conditions were compared by the 16S rRNA and polyphosphate kinase gene sequencing and fluorescence in situ hybridization (FISH) analyses. The acclimation process led a clear shift of Accumulibacter populations from clades IIA (Acc-SG4) > IA (Acc-SG1) > IIF (Acc-SG2) to clades IIC (Acc-SG3) > IA (Ac-SG1) > IIF (Acc-SG2) as well as the increase of other flanking bacteria, Dechloromonas (1.2% to 19.2%) and "Candidatus Competibacter phosphatis" (Competibacter) (16.4% to 20.0%), and the decrease of Accumulibacter (55.1% to 29.2%). A series of batch experiments combined with FISH/microautoradiography (MAR) analysis were performed to characterize denitrifying P-uptake properties of the Accumulibacter clades. In FISH/MAR experiment using lowly diluted sludge (~0.5 g dry weight/liter), all Accumulibacter clades performed successful P-uptake under nitrate condition. However, the Accumulibacter clades failed P-uptake under the nitrate condition when the sludge was highly diluted (~0.005 g/liter), where reduction of nitrate to nitrite was not occurred, while the Accumulibacter clades took up phosphorus successfully using nitrite at the same sludge condition. These results suggest that Accumulibacter cells had no nitrate reduction capabilities, but they were able to uptake phosphorus using nitrite produced from nitrate by other flanking nitrate reduction bacteria such as Dechloromonas and Competibacter.
These results suggest that bacteria in responsible to EBPR systems may be diverse physiologically and ecologically, and represent distinct populations with genetically determined adaptations in EBPR systems. Knowledge of their diversity and functional propeties will benefit the configuration and management of EBPR processes.

국문 초록 (Abstract)

생물학적 인 제거 공정에 관여하는 주요 미생물들의 유전학적, 생리학적 특성에 대한 이해는 공정시스템의 안정적인 운용을 위해 중요한 것으로 인식되어 왔다. 그러나 이들 미생물들은 대표적인 난배양성 미생물로 알려져 있어 미생물의 특성 분석에 있어서 어려움이 존재해 왔다. 따라서, 본 연구는 생물학적 인제거 공정을 수행하는 슬러지 내에 존재하는 주요 미생물들의 다양성과 공정 조건의 변화에 기인한 이들의 생리학적 특성에 대한 규명을 목적으로 수행되었다.
Candidatus Accumulibacter phosphatis (Accumulibacter)로 알려진 인 축적 미생물의 다양성을 밝히기 위해 초산을 탄소원으로 주입한 두 대의 연속회분식 반응기가 구축되었다. 두 대의 반응기는 운전과정 동안 안정적이고 효율적인 인 제거양상를 나타내었고, 반응기 내 슬러지에서 독특한 형태를 보이는 Accumulibacter가 FISH 모니터링 과정동안 관찰되었다. 활성 슬러지 내에 존재하는 미생물들의 16S rRNA 유전자 염기서열을 이용한 계통유전학적 분석은 Accumulibacter가 네 개의 하위그룹으로 나뉨을 명확히 보여주었고, 이들은 각각 Acc-SG1, Acc-SG2, Acc-SG3, Acc-SG4로 명명되었다. 확인된 네 개의 하위그룹을 개별적으로 검출하기 위한 FISH probe가 제작되었고, 이들 probe를 이용한 FISH 분석에서는 Accumulibacter 하위그룹간에 형태의 차이가 존재함이 관측되었다. 그리고, FISH/MAR 혼합방법을 이용한 기능적 분석을 통해 본 연구의 반응기에 존재하는 모든 Accumulibacter 하위그룹이 혐기조건에서 초산를 이용하고 호기조건에서 인을 축적하는 전형적인 인 제거 미생물의 특성을 지니는 것이 확인되었다. FISH와 유세포분석기를 활용하여 개별적인 Accumulibacter 하위그룹 미생물을 농축한 후 polyphosphate kinase 1 유전자(ppk1)의 다양성을 조사한 결과, Accumulibacter들은 서로 다른 ppk1 유전자를 포함하고 있음을 보여주었다. 즉 Acc-SG1, Acc-SG2, Acc-SG3, Acc-SG4에 속하는 Accumulibacter들은 각각 clade IA, clade IIF, clade IIC, clade IIA에 속하는 ppk1 유전자를 포함하는 것으로 나타나, ppk1 유전자의 염기서열에 기초한 기능적 다양성은 앞서 분석된 16S rRNA 유전자를 기초로 한 계통적 다양성과 서로 연관되어 있는 것으로 확인되었다.
16S rRNA 유전자를 이용한 분석은 gammaproteobacteria에 속하는 새로운 글리코겐 축적 미생물 (GB)의 존재의 확인을 가능하게 하였다. 새로운 GB는 계통유전학적 분석에서 이전에 보고된 일곱 개의 GB (GB1 ~ GB7)와는 다른 하위그룹을 형성하였고(GB8), 이들 GB 그룹을 검출하기 위한 FISH probe가 제작되었다. FISH 분석에서 확인된 GB8 미생물은 2-4 µm의 크기를 지닌 coccobacilli 형태를 지녔고, 혐기조건에서 아테트산을 이용하고 호기조건에서 인을 축적할 수 없는 전형적인 글리코겐 축적 미생물의 특성을 나타내었다. 본 연구에서는 GB8을 검출할 수 있는 probe인 GB429 외에 현재까지 보고된 모든 GB 그룹 (GB1 ~ GB8)을 검출할 수 있는 GB742 probe를 제작하였고, 다양한 슬러지 시료를 대상으로 이들 probe를 적용한 FISH 분석은 GB8 미생물이 국내의 다양한 폐수 처리 공정에서 폭넓게 분포하고 있음을 보여주었다.
Accumulibacter가 탈질화 인 제거 미생물(denitrifying PAO, DPAO)의 속성을 지니는지의 여부를 규명하기 위해 무산소 조건을 포함하는 연속 회분식 반응기를 구축하였다. 일반적인 혐기/호기조건(AO)에서 질산염을 사용하여 혐기/무산소/호기 조건(A2O)으로 반응기 내 슬러지를 순화시켰고, 그 결과 무산소 조건에서 탈질화 반응과 동시에 안정적인 인 제거효율을 나타내는 반응기를 구축하였다. AO 조건과 A2O 조건에서 존재하는 Accumulibacter 개체군의 구조를 비교하기 위해 16S rRNA 유전자와 ppk1 유전자를 이용한 계통유전학적 분석과 FISH 분석을 수행하였고, 이들 분석에서 AO 조건에서 A2O 조건으로 슬러지의 순화과정 동안 Accumulibacter 개체군의 뚜렷한 변화가 일어났음이 확인되었다. 주로, AO 조건에서는 clade IIA가 우점 PAO 였으나, A2O 조건에서는 clade IIA는 검출되지 않았고, clade IIC가 우점하는 것으로 나타났다. 또한 탈질화 특성을 지닌 것으로 보고되었던 Competibacter와 Dechloromonas 속에 속하는 미생물들이 A2O 조건의 슬러지에서 크게 증가하였음을 확인하였다. 이후에 수행된 FISH/MAR 실험은 모든 Accumulibacter clade들이 무산소 조건에서 질산염을 이용하지 못하고 아질산염을 전자수용체로 사용하여 인을 축적할 수 있음을 보여주었다. 따라서, 이들 결과를 통해 Accumulibacter는 질산염을 포함하는 무산소 조건에서 각기 다른 생태학적 적응성을 나타내며, 인 제거를 위한 전자 수용체로 질산염을 이용하지 못하고 Competibacter와 Dechloromonas 속의 미생물들에 의해 생성된 아질산염을 이용하여 인의 제거에 관여할 것으로 사료된다.
본 연구는 Accumulibacter의 각 clade가 독특한 생태적 지위를 갖고 다양한 EBPR 시스템에서 인 제거와 관련된 역할을 수행하는 것을 제시하였다. 본 연구를 통해 제시된 결과는 EBPR 시스템의 효율을 극대화하고 시스템의 안정적이고 지속적인 운영을 위한 좋은 참고자료가 될 것으로 판단된다.

목차 (Table of Contents)

• 1.INTRODUCTION 1
• 1.1. Eutrophication 1
• 1.2. Phosphorus removal from wastewater 3
• 1.3. The biochemistry of EBPR system 6
• 1.4. The microbiology of EBPR system through culture dependent and independent approaches 12
• 2. CHAPTER I Analysis of fine-scale population structure of "Candidatus Accumulibacter phosphatis" in enhanced biological phosphorus removal sludge 18
• 2.1. INTRODUCTION 19
• 2.2. MATERIALS AND METHODS 22
• 2.2.1. Operation of sequencing batch reactors 22
• 2.2.2. 16S rRNA gene retrieval and phylogenetic analysis 23
• 2.2.3. FISH probe design and evaluation 25
• 2.2.4. FISH analyses 25
• 2.2.5. FISH/MAR analyses 26
• 2.2.6. Scanning Electron Microscope (SEM) 28
• 2.2.7. Flow cytometric cell sorting 29
• 2.2.8. Selection of the sorted candidate population for analysis of Accumulibacter ppk1 gene homologs 35
• 2.2.9. Analysis of Accumulibacter ppk1 gene homologs 35
• 2.2.10. Nucleotide sequence accession numbers 36
• 2.3. RESULTS 37
• 2.3.1. SBR operation 37
• 2.3.2. Phylogenetic analysis of the 16S rRNA gene clone library 39
• 2.3.3. FISH probe design and evaluation 40
• 2.3.4. FISH and FISH/MAR analyses 45
• 2.3.5. FACS analysis 51
• 2.3.6. Analysis of Accumulibacter ppk1 gene homologs 54
• 2.4. DISCUSSION 59
• 3. CHAPTER II Identification of a novel "Candidatus Competibacter phosphatis" subgroup in enhanced biological phosphorus removal sludge 65
• 3.1. INTRODUCTION 66
• 3.2. MATERIALS AND METHODS 69
• 3.2.1. Operation of a sequencing batch reactor 69
• 3.2.2. DNA extraction and phylogenetic analysis 69
• 3.2.3. FISH probe design and evaluation 70
• 3.2.4. FISH analyses 72
• 3.2.5. FISH/MAR analyses 72
• 3.2.6. Nucleotide sequence accession number 72
• 3.3. RESULTS AND DISCUSSION 73
• 3.3.1. Reactor operation 73
• 3.3.2. Phylogenetic analysis of the new GB subgroup 74
• 3.3.3. FISH probe designs and evaluation 81
• 3.3.4. Ecophysiology analysis of GB8 using FISH/MAR analyses 88
• 4. CHAPTER III Characterization of denitrifying phosphorus uptake properties of "Candidatus Accumulibacter phosphatis" clades 93
• 4.1. INTRODUCTION 94
• 4.2. MATERIALS AND METHODS 98
• 4.2.1. Operation of a sequencing batch reactor 98
• 4.2.2. DNA extraction and phylogenetic analysis 101
• 4.2.3. FISH probe design and FISH analyses 102
• 4.2.4. FISH/MAR analyses 104
• 4.2.5. Nucleotide sequence accession numbers 105
• 4.3. RESULTS 106
• 4.3.1. EBPR performance of SBR 106
• 4.3.2. Population structure of Accumulibacter at the AO and A2O stages 109
• 4.3.3. FISH probe design and quantitative FISH analysis 117
• 4.3.4. Characterization of denitrifying P-uptake properties of Accumulibacter using FISH/MAR analyses 123
• 4.4. DISCUSSION 127
• 5. CONCLUDING REMARKS 133
• 6. FUTURE DIRECTIONS 136
• 7. REFERENCES 139
• 8. 국문초록 164
• 9. ABSTRACT 168