(A)chemical genetic approach to identify novel genes and natural variations for the DFPM-induced signal transduction : 조미리

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part 1. ABSTRACT

Miri Cho
Department of Health Functional Materials
The Graduate School
Duksung Women’s University

An ABA antagonist DFPM regulates root growth through the activation or inactivation of NB-LRR immunity pathways at the root meristem region. For this tissue specific process, the Columbia allele of VICTR is required to produce the DFPM-arrest of primary root growth. Although genes such as EDS1, PAD4, RAR1, and SGT1B involved in plant immune signaling are additionally found to play a role, major components for comprehensive understanding of the underlying mechanisms are not yet discovered. In order to identify genes required for the DFPM function, we have screened mutant populations to isolate dfin (DFPM-insensitive to root growth) mutants. Until now, only 1 dfin mutant has been identified from the screening of 6,350 deletion mutant populations created by fast neutron mutagenesis and its corresponding mutant gene is under investigation. This approach that includes chemical genetics and easy-scoring root arrest phenotypes provides a powerful tool to identify novel components that will allow to dissect more of the R-gene mediated immune signal transduction.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part 2. ABSTRACT

Miri Cho
Department of Health Functional Materials
The Graduate School
Duksung Women’s University

DFPM is a novel chemical compound that negatively regulates primary root growth of the Columbia strain through the activation of NB-LRR immunity pathway. Previously, the VICTR gene from the Columbia strain was found to play a role in DFPM-mediated signaling. The VICTRcol allele contained specific SNPs especially in the region of nucleotide-binding domain of the TIR-NB-LRR gene. It is hypothesized that those Columbia-specific SNPs confer the DFPM sensitivity to VICTRcol and cause a primary root growth inhibition. In order to isolate Arabidopsis strains with Columbia-like DFPM-sensitive root phenotypes, we have tested various Arabidopsis strains for the root DFPM sensitivity and found two other DFPM-sensitive ecotypes, Leo1 and Nie1.2. To identify the specific variation sites in VICTR that are required for the DFPM function, we have sequenced the VICTR gene from various strains and identified several target sites for the DFPM function. The findings indicate that natural variations in the specific region of TIR-NB-LRR genes may provide a structural insight for possible activation mechanisms of TIR-NB-LRR proteins.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part 1. ABSTRACT (in Korean)

조미리
덕성여자대학교대학원
건강기능신소재학과

DFPM은 애기장대(Arabidopsis thaliana)의 특정 아종(accession/ecotype)에서만 뿌리 생장을 조절할 수 있는 저분자 화학 물질이다. 이는, 뿌리의 분열조직에서 면역 조절에 관여하며 NB-LRR 면역 신호 전달 경로를 활성시킴으로써 뿌리 발달을 조절하는 것으로 알려져 있다. 즉, DFPM 처리 시 애기장대 Columbia ecotype에서는 특이적으로 원뿌리 생장이 억제가 되는데 이러한 성질을 조절하는 것으로 Columbia의 대립 유전자인 VICTR 유전자가 보고되었다 (Kim et al., 2012). VICTR 유전자가 소실된 ecotype의 Columbia 돌연변이 애기장대는 DFPM 화학물질을 처리하였을 때 원뿌리의 뿌리 생장 저해 반응을 보이지 않는다. 또한 EDS1, PAD4, RAR1, SGT1B와 같은 유전자들은 식물의 면역 반응 조절에 중요한 역할을 하는 유전자로 알려져 있는데 이들 역시 DFPM에 의한 뿌리 생장 저해에 기능을 하고 있음을 보여주었다 (Kim et al., 2012). 본 실험에서는, DFPM에 의해 유도되어 지는 신호 전달 기작을 조절하는 되는 새로운 여러 유전자들을 확인하기 위해 Fast neutron을 처리한 Columbia background의 6,350개 돌연변이체 집단으로부터 DFPM 처리 시 원뿌리의 생장이 억제되지 않는 dfin(DFPM-insensitive to root growth) 돌연변이 57개를 선별하였다. 이들 중 새로운 돌연변이로 생각되는 1개의 돌연변이체를 선별하고 돌연변이의 위치를 찾는 실험을 진행 중이다. DFPM을 처리함으로서 원뿌리의 생장이 억제되는 Columbia 애기장대 집단으로부터 DFPM의 영향을 받지 않고 원뿌리가 잘 자라는 돌연변이를 골라내는 것은 쉽게 구별할 수 있는 형태학적 표현형이기 때문에 유전학적 연구에 매우 용이하다. 또한, NB-LRR 신호 전달 과정에 있어서 지금까지 알려지지 않았던 새로운 유전자들을 확인하고 이들 유전자들의 상호 신호 전달 기작을 이해하는 데 있어서 획기적인 기회를 제공할 것이라 사료된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Part 2. ABSTRACT (in Korean)

조미리
덕성여자대학교대학원
건강기능신소재학과

DFPM은 애기장대의 신호전달 과정에서NB-LRR 면역체계를 활성화 시킴으로서 애기장대 여러 다양한 종들 중에서도 특히Columbia 종의 원뿌리 생장을 저해하는 화학물질로 알려져있다. Columbia종의 수많은 유전자 가운데VICTR 유전자는 DFPM에 의해 유도되어 유전자 발현이 활성화되는 것으로 밝혀진 바 있다. Columbia종의 VICTR 유전자 부분을 아미노산 염기서열로 분석한 결과, 다른 종들과 달리 Columbia만 특이적으로 갖는 염기서열이 유전자 내TIR-NB-LRR 부분에서 발견되었다. Columbia종에서만 특이적으로 DFPM에 의해 원뿌리 생장 저해반응이 유도되는 이유가 Columbia의 VICTR 유전자 내 특정 염기서열에 있다는 가정 하에 본 연구를 진행하였다. Columbia이외의 다른 종에서도 DFPM을 처리하였을 때, 원뿌리 생장이 저해되는 종들이 있는지를 확인하기 위해서 VICTR 유전자를 포함하고 있다고 알려진 몇 가지 종들을 실험대상으로 하였고, Leo1과 Nie1.2 종에서 뿌리생장 저해반응을 확인했다. DFPM 처리 시 뿌리 생장 저해 반응을 보이는 세 가지의 애기장대 종을 재료로 하여 염기서열을 재분석하였고, 공통적으로 갖는 염기서열을 발견하였다. 총 12곳의 아미노산 염기서열을 찾아내었으며 이 염기서열이 DFPM 에 의해 유도되어 뿌리 생장 저해 반응을 보이는 데 있어 중요한 역할을 함을 보였다. 각각 12개의 아미노산 서열 중에 어떠한 것이 직접적으로 뿌리 생장 저해에 영향을 미치는 지는 아직 연구된 바 없으며, 아미노산 염기서열의 기능을 파악하는 연구를 진행할 예정이다. 이는 TIR-NB-LRR 신호전달 기작에 있어서 그 메커니즘을 이해하는 데에도 중요한 역할을 할 것으로 보인다.

목차 (Table of Contents)

• Part 1. ABSTRACT 2
• 1 INTRODUCTION 4
• 2 MATERIALS AND METHODS 6
• 2.1 Materials 6
• 2.1.1 Plant materials and growth conditions 6
• 2.2 Methods 7
• 2.2.1 Chemical treatment and root growth measurement 7
• 2.2.2 PCR analysis for genotyping 7
• 2.2.3 An isolated mutant crossing with Landsbergerecta (Ler) 9
• 3 RESULTS AND DISCUSSION 10
• 3.1 Forward genetic screening using deletion mutant populations 10
• 3.2 In order to isolate novel genetic components, initial PCR-based screening tests were performed for all candidate mutants 14
• 3.3 A DFPM-insensitive mutant (dfin mutant) was isolated and its F2 generation from the cross with Ler produced DFPM-insensitive root phenotypes 16
• 4 CONCLUSIONS AND DIRECTIONS 17
• 5 BIBLIOGRAPHY 18
• 6 ABSTRACT (in Korean) 19
• Part 2. ABSTRACT 22
• 1 INTRODUCTION 24
• 2 MATERIALS AND METHODS 28
• 2.1 Materials 28
• 2.1.1 Plant materials and growth conditions 28
• 2.2 Methods 29
• 2.2.1 Chemical treatment and root growth measurement 29
• 2.2.2 PCR amplications and analysis of the VICTR strains full-length genomic DNA sequence 30
• 2.2.3 RT-PCR analysis 32
• 3 RESULTS AND DISCUSSION 34
• 3.1 Leo1 and Nie1.2 were isolated as a DFPM-sensitive ecotype 34
• 3.2 VICTR expression in DFPM-sensitive strains was increased in root tissues more than leaf compared with DFPM-insensitive group 37
• 3.3 12 natural genetic variation of DFPM-sensitive VICTR strains causes root growth arrest 39
• 3.4 P-loop, kinase-2, RNBS-B and GLPL sites in Nucleotide-binding (NB) domain do not affect DFPM-sensitive root growth 49
• 3.5 An expectable model for the function of the VICTR TIR-NB-LRR protein in DFPM-mediated recognition 51
• 4 CONCLUSIONS AND DIRECTIONS 52
• 5 BIBLIOGRAPHY 54
• 6 ABSTRACT (in Korean) 60