Arthrobacter sp. L661로부터 cyclohexanone monooxygenase 유전자의 클로닝 및 그 특성 = Cloning and characterization of cyclohexanone monooxygenase gene from Arthrobacter sp. L661
저자
발행사항
대구 : 경북대학교 대학원, 2005
학위논문사항
학위논문(석사)-- 경북대학교 대학원 : 농화학과 2006. 2
발행연도
2005
작성언어
한국어
주제어
발행국(도시)
대구
형태사항
iv, 75 ; 26cm
일반주기명
지도교수 :이인구
소장기관
본 연구는 환경에서 분리된 균주인 Arthrobacter sp. L661 균주에서 cyclohexanone monooxygenase (ChnB) 유전자를 클로닝하였고 대장균에서 이 ChnB를 발현 시켜 효소학적인 특성을 살펴보았다. ChnB를 클로닝하기 위해서 기존에 보고 된 ChnB의 보존적 부위의 아미노산 서열을 이용하여 primer를 제작하였고 제작된 primer를 이용하여 PCR을 수행 PCR 산물을 분석하고 전체적인 chnB 유전자를 클로닝하는 probe로 사용하였다.
Arthrobacter sp. L661 균주에서 추출한 chromosomal DNA는 phage library 기법을 통하여 chnB 유전자를 포함하는 약 18 kb의 DNA 단편을 library에서 선별하였으며 out-PCR 기법을 이용한 primer walking 법으로 총 1,627 bp의 염기서열을 확인하였다.
대장균에서 Arthrobacter sp. L661 균주 유래의 ChnB를 대량발현 시키기 위해 start codon과 stop codon에 적당한 제한효소의 인식부분이 포함된 primer를 제작하고 PCR 하여 생성된 PCR 산물은 제한효소로 처리한 후 ligation을 통해 대량발현 vector인 pET21a(+)에 삽입하여 재조합 DNA인 pETCHMO를 구축하였으며 이를 대장균 BL21(DE3)에 집어넣어 형질전환 된 균주를 제작하였다.
pETCHMO에 의해 발현되는 ChnB의 효소 활성을 확인하고 이를 정제하기 위해 다시 C-말단에 histidine 잔기 6개로 구성된 His-tag을 붙인 fusion protein을 발현시키는 pETCHMO-his를 구축하고 ChnB-[His-tag] fusion protein을 발현 시켰다.
효소의 정제는 Ni2+-NTA His․bind resin을 이용한 affinity chromatography를 통해 ChnB-[His-tag] fusion protein을 정제하였다. 정제된 효소는 조효소액에 비해 약 8.3 배의 비활성 증가를 보였으며 회수율은 37.1%이었다.
정제된 Arthrobacter sp. L661 균주 유래의 ChnB를 이용하여 효소적인 특성을 조사하였는데 최적 pH는 100 mM citrate-phosphate 완충용액 사용영역인 pH 7.0으로 확인되었으며 pH 7.0 ~ 8.5 구간에서 약 70% 이상의 활성을 가지는 것으로 나타났고 효소의 pH 안정성은 pH 6.5 ~ 8.0의 비교적 넓은 영역 사이에서 약 70% 이상의 활성을 유지하는 것을 확인하였다. 여러 가지 기질에 대한 특이성은 cyclohexanone에 대해서 가장 높은 활성을 나타내었으며 cyclohexanone 이외에 탄소수가 적은 cyclic ketone에서도 높은 활성을 보여주었다.
비록 본 연구에서 Arthrobacter sp. L661 균주에서 Baeyer-Villiger oxidation 반응을 수행하는 chnB 유전자를 클로닝하고 대장균에서 발현시켜 효소학적인 특성도 살펴보았지만 앞으로 대장균 발현에서 발생되는 문제점인 inclusion body의 생성을 줄일 수 있는 방법에 대한 보충 연구가 필요하며 이러한 효소를 대량 생산을 위한 공업적 반응에 이용하기 위해서 반응에 필수적으로 소모되는 NADPH의 공급 문제도 해결해야 될 것이다.
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