メチル水銀耐性に關わゐ細胞內因子の檢索とその作用���構解析
저자
발행사항
仙台 : 東北大學大學院, 2002
학위논문사항
Thesis(doctoral)-- 東北大學大學院: 藥學硏究科 生命藥學專攻 2002
발행연도
2002
작성언어
일본어
주제어
KDC
518 판사항(4)
형태사항
76 p. ; 26cm.
소장기관
メチル水銀は人體に重篤な中樞神經障害をもたらすが, その毒性發現機構およびそれに對する防御機構はほとんど解明されていない. 本硏究では, メチル水銀に對する防御機構を明らかにするために, 酵母を用いてメチル水銀耐性に開わる遺傳子の檢索を行い, ユビキチン轉移酵素ファミリ-の中の1つであるCdc34 (Ubc3) の高發現が酵母にメチル水銀に對する耐性を與えることを新たに見出した. なお, このCdc34高發現酵母はメチル水銀以外にも他の水銀化合物 (HgCl₂やpCMB) やパラコ-ト, CdCl₂に對して耐性を示した. Cdc34が關與するユビキチンシステムはユビキチン活性化酵素 (E1), ユビキチン轉移酵素 (E2) 及びユビキチンリガ-ゼ (E3) で構成され, 異常蛋白質の分解等に關與することが知られている重要な細胞內機能の一つである.
まず, 耐性獲得に必要な機能domain檢索のために, E2活性に關與することが報告されている數ヶ所のdomainに變異を有するcdc34をそれぞれ高發現する酵母を作製したところ, これらの酵母においてはメチル水銀に對する耐性は認められなかった. また, 正常なCdc34を高發現させた酵母ではユビキチン化された蛋白質量の增加が認められたが, 變異Cdc34を高發現させた酵母ではこのような現象も認められなかった. このことから, Cdc34高發現によるメチル水銀耐性にはCdc34が示すユビキチン轉移活性が必須であると考えられる. 次に他のE2蛋白質であるUbc4, Ubc5またはUbc7を高發現する酵母を作製し, メチル水銀に對する感受性について檢討したところ, Cdc34高發現酵母よりその程度は劣るものの, Ubc4, Ube5またはUbc7高發現酵母においてもメチル水銀耐性が認められた. ここで認められる耐性度の差は, 恐らく各E2分子種の基質特異性の差を反映しているものと考えられる. 一方, E1 (Uba1) およびE3 (Cdc53, Skp1, Hrt1) に開しても同樣に檢討したところ, E1高發現酵母でのみ僅かなメチル水銀耐性が認められた. またこれら酵母內においては, ユビキチン化蛋白質量の增加は殆ど認められなかった. 以上の結果から, E2はユビキチン化反應の律速酵素であり, 本酵素群の高發現は細胞內における蛋白質のユビキチン化を促進させることによってメチル水銀毒性に對して防御的に作用するものと考えられる. これまでに, メチル水銀毒性にユビキチンシステムが關與することを示唆するような報告はなく, 本知見はメチル水銀毒性の發現機構とそれに對する防御機構を解明するうえでの有力な手がかりを提供するものと考えられる.
ユビキチン化された標的蛋白質は最終的にプロテアソ-ムに認識されて速やかに分解される. そこで次に, プロテアソ-ムによる分解がCdc34高發現によるメチル水銀耐性獲得におよぼす影響を檢討したところ, プロテアソ-ム阻害劑存在下ではCdc34高發現によるメチル水銀耐性が認められなくなった. さらに, 遺傳子變異によって低プロテアソ-ム活性を示す酵母 (WCG4-11a) がcontrol酵母 (WCGfa) に比べて高いメチル水銀感受性を示すことも確認された. これらの結果から, Cdc34高發現によるメチル水銀耐性にはプロテアソ-ムによるユビキチン化蛋白質の分解が必須であると考えられる.
以上の結果から, ユビキチン-プロテアソ-ムシステムが關與するメチル水銀の毒性發現機構およびそれに對する防御機構として以下のような可能性が考えられる. すなわち, ある種の特定な蛋白質がメチル水銀によって何らかの修飾を受け, この修飾蛋白質が細胞內に蓄積することによって細胞障害が引き起こされる. 一方, メチル水銀によって修飾を受けた蛋白質のユビキチン化を介したプロテアソ-ムでの分解の促進がメチル水銀毒性げ對して防御的に作用する. そうであれば, メチル水銀によりユビキチン化および分解が促進される蛋白質がメチル水銀の標的蛋白質ということになる. ヒトのCDC34 (hCDC34) を高發現させたHEK293細胞もメチル水銀に對して耐性を示すことが確認されたことから, メチル水銀によって修飾を受けてユビキチン化される蛋白質をヒト細胞中で同定できれば, ヒトにおけるメチル水銀の細胞內標的分子が明らかになるものと期待される.
一方, methionine合成經路においてS^(2-)とO-acetylhomocysteineからhomocysteineを合成する酵素であるMet25に變異のある酵母が細胞內に高濃度のS^(2-)を蓄積することによってメチル水銀耐性を示すことが報告されているが, 本酵素は轉寫因子Met4によって發現制御されており, 最近, Met4がCdc34の關與するユビキチン化反應によって分解されることが判明した. この現象もCdc34高發現によるメチル水銀耐性に關わっている可能性も考えられることから, methionine合成經路中でSO₃^(2-) (S^(2-)の前驅體) の生成に關わる酵素をコ-ドするMET16遺傳子あるいはMET25遺傳子を欠損させた酵母を作製してメチル水銀に對する感受性を檢討したところ, MET16遺傳子を欠損した酵母は野生株に比べて高いメチル水銀感受性を示し, MET25遺傳子欠損株は逆に野生株に比べて顯著なメチル水銀耐性を示した. 細胞內のS^(2-)濃度はMet16欠損により減少し, Met25欠損によって增加すると考えられることから, この結果はメチル水銀毒性の輕減にS^(2-)が關わるというこれまでの知見を强く支持している. Cdc34の高發現がMET25およびMET16遺傳子の發現を抑制することも確認されたが, MET25またはMET16遺傳子欠損株にCdc34を高發現させることによって兩株ともメチル水銀に對する耐性度が上昇した. この結果から, Cdc34高發現によるメチル水銀耐性にはMet4のユビキチン化促進によるS^(2-)の蓄積も關與するものの, その他の機構, すなわち, メチル水銀によって修飾を受けた蛋白質のユビキチン化を介した分解促進も比較的大きく關與するものと考えられる. なお, Cdc34高發現酵母がメチル水銀と同樣に耐性を示すカドミウムの場合は, MET25またはMET16遺傳子欠損株にCdc34を高發現させても耐性が認められなかったことから, Cdc34高發現によるカドミウム耐性獲得機構はメチル水銀の場合とは異なり, Met4のユビキチン化を介するMET25の發現抑制が主であると思われる.
また, Cdc34高發現酵母がパラコ-トに對しても耐性を示したことから, その耐性機構を檢討したところ, パラコ-トはメチル水銀と異なり細胞內蛋白質のユビキチン化を抑制することが判明した. パラコ-トは細胞內ユビキチン化反應を阻害することによって細胞毒性を示し, Cdc34を高發現させた場合には細胞內のユビキチン化活性が上昇するため, この活性の十分な阻害にさらに强い酸化ストレスが必要となって結果的に耐性を示すのかもしれない.
本硏究によってユビキチン-プロテアソ-ムシステムが樣樣な機構でメチル水銀などの外來物質の毒性に對して防御的に作用することが初めて明らかとなった. また, Cdc34の高發現が外來物質に對して防御的に作用するとの報告もこれまでになく, 本硏究結果が最初の知見である. 本硏究結果はメチル水銀細胞毒性の發現機構およびそれに對する防御機構の解明に有用な手がかりを與えるだけでなく, ユビキチン-プロテアソ-ムシステムの新しい役割の解明にも大きく貢獻し得るものと思われる.
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