Discovery of ARPC2 modulator by connectivity map and Investigation of its anti-metastatic activity
저자
발행사항
대전: 忠南大學校 大學院, 2020
학위논문사항
학위논문(박사)-- 忠南大學校 大學院 : 생명과학과 분자세포생물학 및 발행유전학 전공 2020. 2
발행연도
2020
작성언어
영어
DDC
571 판사항(22)
발행국(도시)
대전
기타서명
Connectivity map 분석을 통한 ARPC2 조절물질의 탐색과 암전이 억제 기전 연구
형태사항
vii, 81 p.: 삽화; 26 cm.
일반주기명
충남대학교 논문은 저작권에 의해 보호받습니다.
지도교수: 김철희
참고문헌 : p. 68-76.
UCI식별코드
I804:25009-000000081902
소장기관
ARPC2 is a subunit of the Arp2/3 complex, which is essential for lamellipodia, invadopodia and filopodia, and ARPC2 has been identified as a migrastatic target molecule. To identify ARPC2 inhibitors, I generated an ARPC2 knockout DLD-1 human colon cancer cell line using the CRISPR/Cas9 system and explored gene signature-based strategy, such as a connectivity map (CMap) using the gene expression profiling data of ARPC2 knockout and knockdown cells. From the CMap-based drug discovery strategy, I identified pimozide (a clinically used anti-psychotic drug) as a migrastatic drug and ARPC2 inhibitor. Pimozide inhibited the migration and invasion of various cancer cells. Through drug affinity responsive target stability (DARTS) analysis, cellular thermal shift assay (CETSA) and pull-down assay, it was confirmed that pimozide directly binds to ARPC2. Pimozide increased the lag phase of Arp2/3 complex-dependent actin polymerization and inhibited the vinculin-mediated recruitment of ARPC2 to focal adhesions in cancer cells. To validate the likely binding of pimozide to ARPC2, mutant cells with altered amino acids at the expected binding site were prepared. Pimozide strongly inhibited the migration of ARPC2F247A and ARPC2Y250F mutant cells, consistent with the calculation of binding affinity. In other mutated cell, ARPC2E184A and ARPC2F185A, pimozide was resistant to the inhibitory effect of migration. Therefore, pimozide is a potential ARPC2 inhibitor and ARPC2 is a new molecular target. Taken together, the results of this study provide new insights into the molecular mechanism and target that are responsible for the antitumor and anti-metastatic activity of pimozide.
더보기암 환자 사망의 90% 이상의 원인은 전이 때문이며, ‘세계보건기구’ 에서 암 사망의 주범은 전이라고 밝혔다. 암 전이는 혈관을 통한 세포의 이동에 의해 일어나며, 세포는 이동하려는 방향으로 액틴섬유를 모아 세포막을 길게 늘어뜨려 다리처럼 이용한다. ARPC2는 액틴의 형성에 관여하는 단백질인 Arp2/3 복합체 중 하나로, 최근 암 전이 억제의 표적 단백질로 효과적인 결과를 보였다. 본 연구에서는 ARPC2 의 조절물질을 찾기 위해서, 먼저 CRISPR/Cas9 system을 이용하여 ARPC2가 결손된 대장암 세포주를 제작하였다. ARPC2가 결손된 대장암 세포주는 이동속도가 현저히 줄어들어 있었으며, 층상위족의 형성이 감소되어 있었다. 그리고 원래의 대장암 세포주와의 connectivity map분석을 통해 유전자 발현 양상을 비교한 결과, 결손 세포주와 비슷한 발현 양상을 가진 화합물 10개 중 현재 항정신성약물로 쓰이고 있는 pimozide를 선택하였다.
Pimozide는 대장암 세포주 뿐만 아니라 다른 종류의 암세포들의 이동도 저해했으며, 전이 동물 모델에서도 효과적인 억제 효과를 나타냈다. Pimozide의 타겟을 찾기 위한 방법으로 DARTS assay와 CETSA 그리고 pull down assay를 이용하였으며, 그 결과 ARPC2에 직접 결합한다는 것을 확인하였다. Pimozide는 Arp2/3 복합체가 유도하는 액틴의 중합반응을 지연시켰으며, 세포내 신호전달에 의해 세포와 기질이 결합할 때 필요한 vinculin단백질과 ARPC2의 결합을 감소시키며, 층상위족이 형성되지 않는 것을 확인하였다. ARPC2 결손 대장암 세포주에 예측되는 결합부위를 돌연변이 시킨 ARPC2 단백질을 역으로 발현시켜 실험해본 결과, 예측한 E184, F185, F225, F247 그리고 Y250에 둘러 쌓인 포켓에 pimozide가 결합한다는 것을 확인하였다.
본 연구를 통해 pimozide의 전이 억제 효과는 ARPC2의 직접적인 결합을 통해 이루어짐을 확인하였으며, connectivity map을 통한 약물의 새로운 분자적 기전 연구 및 탐색의 새로운 방법을 제시하였다.
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