Activation of peroxiredoxin by Human cyclophilin

국문 초록 (Abstract)

Peroxiredxoxin(Prx)은 과산화수소를 제거하는 항산화 효소로, isotype에 따라 세포 내에 분포하거나 세포외부로 분비된다. Cyclophilin(CyP)은 면역억제물질인 cyclosporin A(CsA)의 세포내 수용체로서 PPIase의 효소 활성을 가지고 있다.
현재까지 발견된 사람의 6가지 Prx isotype(Ⅰ∼Ⅳ and Ⅵ, 400㎍/㎖; Ⅴ, 200㎍/㎖) 모두가 hCyP(200㎍/㎖)에 의해서 항산화 활성이 20 ∼ 50%가 증가하였다. 그러나 효모 (S. pombe와 S. cerevisiae)의 Prx는 hCyP을 400㎍/㎖까지 처리해도 hCyP에 의한 Prx활성화를 보이지 않았다.
hCyP에 의한 Prx의 활성화 메커니즘을 밝히고자 in vitro에서 hCyP에 의한 Prx의 환원을 SDS-PAGE와 Immuno blot으로 확인하였다. hCyP은 비생리적 전자공여체인 DTT의 도움없이도 Prx-Ⅱ를 환원 (25kDa)하였지만, DTT에 의해 환원된 Trx의 효과보다는 덜하였다. 그러나 hCyP에 NEM을 처리하면 환원형 Prx가 나타나지 않았다. 즉, hCyP은 Prx에 cysteine 잔기를 통해 전자를 전달한다는 것을 알 수 가 있었다.
hCyP의 총 4개의 cysteine 중에서 반응 가능한 것의 수를 구하기 위해 DTNB를 사용하였다. hCyP의 cysteine잔기 2개가 DTNB와 반응하였으며 GuHCl을 처리해도 흡광도의 증가가 없는 것으로 미루어 DTNB와 반응한 2개의 cysteine잔기는 외부에 노출되어 있음을 알 수가 있었다. 또한 hCyP에 NEM을 처리하면 DTNB와 반응하지 않았다. hCyP의 억제제인 CsA를 처리하면 Prx-Ⅱ의 환원이 2배정도 증가함을 관찰하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Peroxiredoxin(Prx) is a growing family of thiol peroxidases which has (a) reactive cysteine residue(s) in its active site. Until now six isotypes of Prx(PrxⅠ∼Ⅵ) have been reported in mammalian system and the immediate electron donor for five isotypes(Ⅰ∼Ⅴ) has been identified as Trx but that of Prx-Ⅵ is still unclear. Cyclophilin(CyP) defines a family of proteins binding to the immunosuppressive drug cyclosporin A(CsA) and possesses the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase(PPIase) activity.
Human cyclophilin, (hCyP, 200㎍/㎖) enhanced the GS protection activity of all known human Prx isotypes(Ⅰ∼Ⅳ and Ⅵ, 400㎍/㎖; Ⅴ, 200㎍/㎖) with the increment of 20 to 50% of their basal activity. However, up to 400㎍/㎖ of hCyP did not show the capacity to stimulate the GS protection activity of Prx from two types of yeast(S. pombe and S. cerevisiae), reflecting a specific interaction between the hCyP and the human Prx. Activation of GS protection of Prx-Ⅱ was acquired by the flow of electrons from hCyP to Prx-Ⅱ was confirmed by NEM modification. However, the reduction of Prx-Ⅱ was not stimulated by the addition of DTT (100μM). Two exposed, DTNB modifiable cysteine residues of hCyP might involve the reduction of Prx-Ⅱ. In addition, Prx-Ⅱ reduction by hCyP was increased about two-fold by the addition of CsA (170㎍/㎖) to the reaction mixture. These results strongly support the functional role of hCyP as a immediate electron donor of all known Prx isotypes and as far as we know this is the first report of the immediate electron donor for the peroxidase activity of Prx-Ⅵ.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 = 1
• I. 서론 = 2
• II. 재료 및 방법
• 1. 시약 = 8
• 2. hCyP PCR 클로닝과 단백질 발현 = 8
• 3. hCyP 정제
• 3.1. Crude extracts 제조 = 9
• 3.2. Streptomycin sulfate 및 ammonium sulfate 처리 = 9
• 3.3. DEAE-Sephacel column을 이용한 hCyP 정제 = 9
• 3.4. HPLC Heparin 5-PW column을 이용한 hCyP 정제 = 10
• 4. SDS-PAGE 젤 전기이동 = 10
• 5. Western blot과 immune detection = 10
• 6. Glutamine synthetase 불활성화를 이용한 항산화활성 측정 = 11
• 7. 비환원 조건의 SDS-PAGE를 사용한 Prx-II의 산화ㆍ환원 분석 = 11
• 8. DTNB를 이용한 hCyP의 sulfhydryl group의 갯수 결정 = 12
• III. 결과
• 1. PCR 클로닝과 단백질 발현 = 13
• 2. 단백질 정제 = 13
• 3. hCyP에 의한 Prx의 항산화활성 증가 = 13
• 4. hCyP와 Prx의 종특이적 반응 = 18
• 5. hCyP에 의한 Prx의 항산화활성 증가 메커니즘 = 22
• 6. hCyP의 산화환원반응이 일어나는 자유 티올기의 갯수 결정 = 22
• 7. CsA가 hCyP에 의한 Prx-II 환원에 미치는 효과 = 25
• IV. 고찰 = 29
• V. 참고 문헌 = 33
• 영문초록 = 40