Antagonistic effect of Burkholderia cepacia strain JBK9 against phytopathogenic fungi: A multi-omics analysis to find the cause of changed antagonistic ability by long-term culture : Burkholderia cepacia JBK9의 식물병원성 곰팡이에 대한 길항효과 및 장기간 배양에 따른 길항능력 변화의 원인 규명을 위한 오믹스 분석
Burkholderia 종은 다양한 환경에 넓게 분포하는 것으로 알려져 있다. 몇몇 Burkholderia 종들은 식물 내생, 식물생장 촉진, 식물병해 방제와 같은 식물과 매우 밀접하게 관련된 곳에서 많이 발견되었다. Burkholderia cepacia complex에 속하는 Burkholderia cepacia JBK9은 경상북도의 작물재배지역의 작물 근권 토양에서 분리되었다. 이렇게 분리된 미생물은 P. capsici, F. oxysporum, R. solani 와 같은 식물병원성 곰팡이에 대해 우수한 길항능력을 나타내었다. 식물병원성 곰팡이 생장 저해 능력은 59.56% (P. capsici), 51.92% (F. oxysporum), 34.22% (R. solani) 으로 나타났다. 이렇게 다양한 식물병원성곰팡이 길항능력을 가지는 JBK9을 분리하게 되었다. 또한, 16S rRNA gene sequence 분석을 통해 Burkholderia cepacia 종으로 정의 하였다. B. cepacia JBK9의 배양상등액에서 추출된 물질의 경우, TLC, HPLC, GC-MS, NMR분석을 통해 pyrrolnitrin이라는 항진균 활성 물질로 동정하였다.
분리된 B. cepacia JBK9은 PacBio 사의 SMRT sequencing 분석장비를 통해 genome sequence 분석을 실시하였다. 그 결과로, 전체 95,084 reads를 얻을 수 있었다. 생산된 reads를 사용해 HGAP assembly 분석 프로그램을 사용하여 contig로 조립하였다. 그 결과 3개의 contig가 생성되었고, 8.481 Mbp 사이즈, 66.81%의 GC 함량, 104x coverage를 얻을 수 있었다. 완성된 genome sequence정보는 미국 NCBI사이트에 등록하였고, GenBank 등록번호 : CP013730, CP013731, and CP013732를 받았다. 본 정보를 gene annotation를 분석하여 gene 정보를 확보하였다. Genome sequence정보에서 pyrrolnitrin 합성 유전자인 prnABCD를 발견하였다. 20종의 Burhkolderia와 Pan genome 분석을 통해 22,087의 ortholog cluster를 분석하였고, 2,448의 core genome을 찾아냈다. Pan genome 분석을 통해 1차 대사과정에 필요한 유전자들이 주로 핵심적으로 작용한다고 밝혀냈다.
장기간 배양한 (1,000 doubling time) B. cepacia JBK9의 경우, 그렇지 않은 경우보다 식물병원성 곰팡이에 대해 길항능력이 감소하는 것으로 나타났다. 배양전 P. capsici에 대해 1.9mm의 억제 능력을 나타냈으나, 장기간 배양후에는 0.4 mm의 억제 능력을 나타냈다. 또한 장기간 배양후에는 미생물의 swimming, swarming 이동능력이 크게 감소하는 것으로 보였다. 이 결과를 바탕으로 미생물의 뿌리 흡착능을 분석하여, B. cepacia JBK9 (PV) (2.54 x 105 CFU/cm root), B. cepacia JBK9 (N) (3.15 x 105 CFU/cm root) 으로 보였고, 미생물의 이동 능력이 우수한 것이 뿌리 흡착능이 더 우수하다는 것을 알 수 있었다. 고추를 사용하여 포트 재배시에 병징 차이를 알아보았을 때도 배양 전후에 따라 약간의 차이가 나타났다. 또한 근권 미생물 분포도를 NGS장비를 활용해 분석한 결과, B. cepacia JBK9 (N)을 접종하였을 때 가장 높은 betaproteobacteria 분포도를 보였다. 이동능력, 뿌리 흡착능의 차이가 근권 미생물 군집에 영향을 미치는 것으로 판단 되었다. P. capsici의 길항능력 저하의 원인을 확인하기 위해, pyrrolnitrin 생산능에 대한 분석을 TLC, HPLC 분석법을 통해 진행하였다. 그 결과, 장기간 배양된 미생물의 경우 pyrrolnitrin의 생산이 저하되는 것으로 보였다. 기존에 알려진 문헌에서는 quorum sensing 물질에 의해 조절 된다고 알려졌으나 본 연구에서는 무관하다는 것이 밝혀졌다. 그 결과 다른 조절인자에 의해 pyrrolnitrin의 생산이 조절된다고 판단되었다.
장기간 배양후에 미생물의 분자생물학적 영향을 알아보기 위해, Phenotype microarrary분석을 실시하였다. 그 결과, 장기간 배양된 미생물의 경우, 그렇지 않은 경우 보다 약간의 양분 흡수 능력이 증가하는 것으로 나타났다. 또한, Ion Proton 장비를 활용해 SNP 분석을 실시하여 Chromosomal DNA1 (35), Chromosomal DNA2 (40), Chromosomal DNA3 (22)를 찾아내었고, pyrrolnitrin 합성 유전자 부분의 조절인자로 추정되는 LysR 조절인자의 결손을 확인하였다. RNA-seq 분석을 통하여 LysR 조절인자의 발현율이 감소하는 것으로 나타났고, pyrrolnitrin에 대한 유전자 발현율도 같이 감소하는 것으로 나타났다. 또한 이동능에 관련된 flagellin 유전자 합성에 관련된 발현율도 감소하는 것으로 나타났고, 같이 존재하는 조절인자의 발현율도 감소하는 것으로 나타났다. 그 결과, pyrrolnitrin합성은 LysR 조절인자에 의해 조절 된다는 것으로 밝혀졌다. 장기간 배양 전후의 B. cepacia JBK9의 단백질 변화분석을 실시하였다. 그 결과, 장기간 배양 전의 B. cepacia JBK9의 경우 새로운 생육환경에 적응을 하기 위해 Chaperon관련 단백질들이 많이 발현 되는 것으로 나타났다. 새로운 환경 적응을 위해 stress 관련 단백질들이 발현된 것으로 생각된다.
Burkholderia species are widely distributed across diverse environmental niches. Several members of the genus Burkholderia are found in close association with plants and are involved in processes such as endophytic colonization, plant growth promotion, and suppression of plant pathogens. In present study, Burkholderia cepacia strain JBK9, which belongs to the Burkholderia cepacia complex, was isolated from rhizospheres of cultivated crops in Gyeongsangbuk-do, South Korea. The isolated strain JBK9 was found to exhibit 59.56%, 51.92% and 34.22% against Phytophthora capsici, Fusarium oxysporum, and Rhizoctonia solani, respectively. B. cepacia JBK9 was identified by 16S rRNA gene sequencing. An antifungal compound produced by B. cepacia JBK9 was confirmed to be pyrrolnitrin based on thin layer chromatography, high performance liquid chromatography, gas chromatography-mass spectrometry and nuclear magnetic resonance analyses.
Here, the complete genome sequencing of B. cepacia strain JBK9 was sequenced at 104x coverage using single molecule real-time (SMRT) sequencing platform on a PacBio RS II instrument. A total of 95,084 reads were obtained from one SMRT cell using the P6C4 chemistry. Raw reads were de novo assembled using HGAP protocol 2.0 in SMRT analysis software, which generated three replicons with a total size of 8.481 Mbp and GC content of 66.81%. Whole genome sequencing of strain JBK9 was completed in January 2016. Sequence was deposited in GenBank under the accession numbers : CP013730, CP013731, and CP013732. Gene annotation predicted a total of 7,527 protein-coding sequences. Results also showed that B. cepacia JBK9 harbors genes involved in the synthesis of pyrrolnitrin (prnABCD), a common broad-spectrum antifungal agent. Pan-genome analysis of 20 Burkholderia chromosomes revealed that 22,087 ortholog clusters from a total of 130,457 genes that constitute the pan-genome. The core genome consist of 2,448 ortholog clusters. The core genomes showed high ratios in the translation and nucleotide metabolism categories.
After in vitro subculture of 30 passages (approximately 1,000 generations) in LB medium for one day, the antifungal activity of B. cepacia JBK9 (B. cepacia JBK9 [PV]) was compared to that of B. cepacia JBK9 strain that had not been maintained under long-term culture (B. cepacia JBK9 [N]). B. cepacia JBK9 (N) and B. cepacia JBK9 (PV) showed fungal growth inhibition zones of 1.9 mm and 0.4 mm, respectively. Two types of motility were observed in B. cepacia JBK9: swimming (spreading through the semisoft medium) and swarming (spreading across the surface). Using an in vitro assay for root colonization, we observed that the population densities on the upper 1 cm of host roots were not significantly different between B. cepacia JBK9 (PV) (2.54 x 105 CFU/cm root) and B. cepacia JBK9 (N) (3.15 x 105 CFU/cm root) strains. The phase variation after long-term culture of B. cepacia JBK9 decreased disease control values by approximately 7%. We also observed that the community composition of Betaproteobacteria differed in soil samples, with a mean abundance of 8.5% (Water only), 12.3% (JBK9 (N)), 8.7% (JBK9 (PV)), 7.9% (KCTC 2973), 8.3% (ATCC 25416), and 4.7% (fungi only). The strong motility of B. cepacia JBK9 (N) was closely associated with the root of the plant. We demonstrated using TLC and HPLC analyses that the B. cepacia JBK9 (PV) strain does not produce pyrrolnitrin. However, lack of pyrrolnitrin production was not regulated by quorum sensing genes.
To analyze the effects of phase variation in B. cepacia JBK9, a Phenotype Microarray (PM) (Biolog) analysis was performed between B. cepacia JBK9 (N) and B. cepacia JBK9 (PV). We confirmed that B. cepacia JBK9 (N) grows significantly slower than B. cepacia JBK9 (PV) in most nutrient sources, including carbon, nitrogen, phosphorous, and sulfur. Using Ion Proton genome sequencing, we found 35, 40, and 22 single nucleotide polymorphisms (SNP) on Chromosomal DNA1, Chromosomal DNA2 and Chromosomal DNA3, respectively. We also confirmed the presence of SNPs in the LysR transcriptional regulator on Chromosomal DNA3. This regulator is located close to the pyrrolnitrin gene cluster. Further RNA-seq analysis demonstrated that the pyrrolnitrin and flagellin gene clusters exhibit decreased gene expression after long-term culture. However, quorum-sensing genes did not display any changes in expression. The differences in pyrrolnitrin gene expression may be due to SNPs identified in the LysR transcriptional regulator. Finally, we identified differentially expressed proteins between B. cepacia JBK9 (N) and B. cepacia JBK9 (PV) using 2D-PAGE analysis. The chaperon proteins GroEL and DnaK were observed to be lower in abundance in B. cepacia JBK9 (PV) compared to B. cepacia JBK9 (N). These chaperones prevent protein mis-folding and promote refolding under stress conditions.
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