In vito activity 와 kinetic analysis를 통한 ErmSF와 23S rRNA의 interaction mode의 연구 = Studies on interaction mode of ErmSF with 23S rRNA through in vitro activity and kinetic analysis
저자
진형종 (수원대학교 자연과학대학 유전공학과)
발행기관
수원대학교 자연과학연구소(THE INSTITUTE OF NATURAL SCIENCES THE UNIVERSITY OF SUWON)
학술지명
권호사항
발행연도
2000
작성언어
Korean
주제어
KDC
470.000
자료형태
학술저널
수록면
156-171(16쪽)
제공처
Recently, frequent appearance of bacterial pathogens resistant to various available antibiotics is the most serious problem to the health and life of human being. One of the most plausible strategies to overcome this medical disaster is to develop the inhibitor of antibiotic resistance factor. ErmSF is a methyltransferase that confers resistance to the MLS (macrolide-lincosamide-streptograminB group) antibiotics by catalyzing the mono- or dimethylation of 23S rRNA peptidyltransferase loop at a specific N6-position of adenine residue(A2085 in Bacillus subtilis). The ermSF gene was cloned from Streptomyces fradiae NRRL2702 by PCR method and expressed to a high level in E. coli BL2l(DE3). ErmSF was obtained and purified as a soluble form in the yield of 126㎎/L culture and the enzyme efficiently methylates a 23S rRNA [Jin. H. J.(1999) Mol. Cells ]and also a 623nt transcript of domain V of 23S rRNA in vitro. Domain V of 23S rRNA was reported to have all the elements required for full erm methyltransferase activity [ Jin. H. J., et at. (1994) J. Bacteriol, 176, 6992-69981]. By progressively truncating domain V (DV, 432, 243, 66, 52, 41, 38, 27nt RNA), novel 27nt RNA minimalist substrate for ErmSF was identified, Unlike the other homologous erm proteins, ErmSF contains long N-terminal end region(71 a. a), 25% of which amino acids is composed of arginine known to interact well with RNA. From this characteristic and results of our preliminary experiments, this region is thought to interact with nucleotides of DV stems 74-79. To confirm this notion, antibiotic susceptibility assay, in vitro methylation and kinetic analysis using the wild type and the N-terminal end region truncated ErmSF and various RNAs mentioned above were carried out. Even though it confers resistance to erythromycin in E. coli, in in vitro methylation reaction, N-terminal end region truncated ErmSF showed only 30% activity compared to the wild type ErmSF in vitro. The kinetic studies performed under the conditions that only monomethylation occurs showed that the apparent Km of 243nt RNA(462 nM) and 66nt RNA(3787.5 nM) was 9 fold and 69 fold greater than the value determined for DV(44.43 nM), respectively. In addition, the Vmax for these fragments also increased 1.4 fold(1.15 pmol/min/㎎ ErmSF) and 4.2 fold(3.37 pmol/min/㎎ ErmSF) compared to that of DV(0.84 pmol/min/㎎ ErmSF). In contrast, when these RNA substrates were interacted with N-terminal end region truncated ErmSF, the Km values of DV, 243nt and 66nt RNAs were 851.32 nM, 25281.1 nM and 98096.7 nM. Vmax values were 1.59 pmol/min/㎎ ErmSF, 2.2 pmol/min/㎎ ErmSF and 40.32 pmol/min/㎎ ErmSF. When these values were compared with that obtained using the wild type ErmSF with DV, Km value were increased 17 fold, 52 fold and 2097 fold and Vmax value were also increased 1.9 fold, 2.6 fold and 49 fold.
Therefore, these results suggested that N-terminal end region of ErmSF directly interact with seem 74-79 of 23S rRNA and enhance the protein-RNA interaction for methyl group accepting activity.
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