Bacillus sp.가 생성하는 β-1, 3-Glucanase에 관한 硏究

국문 초록 (Abstract)

토양에서 β-1,3-glucanase(E.C.3.2.1.39)를 생성할 수 있는 bacterium을 분리하여, Bacillus 속으로 동정하였다. 효소 생성에 대한 배지의 구성과 배양조건의 효과를 검토한 결과, 실험한 탄소원 중 curdlan(β-1,3-glucan)이 효소 생성에 가장 효과적이였으며, mono-와 disaccharides는 일반적으로 효과가 없었다. 그러므로, 이 효소는 탄소원으로 β-1,3-g1ucan에 의해서만 유도되어 지는 것으로 보이며, 효소 생성을 위한 curdlan의 최적 농도는 7.5%였다. 또한 질소원으로는 여러 질소원들 중 baker's yeast cell에 의해 가장 높게 유도되었으며, 배양 배지에서 glucose의 존재에 의해 효소 합성이 억제되는 catabolite repression 현상도 나타났다. 1%의 yeast extract와 2%의 peptone에 7.5%의 baker's yeast나 5%의 curdlan을 각각 포함한 효소 생성 유도 배지를 이용하여 미생물의 배양 조건을 검토한 결과, 분리된 Bacillus sp.는 32 ℃, pH 6.0에서 최고의 효소 생성을 나타내었다.
토양에서 분리된 Bacillus sp.로부터 생성된 β-1,3-glucanase는 ethanol침전, Sephacryl S-200 gel filtration과 DEAE-Sephacel ion-exchange chromatography에 의해 부분적으로 정제되었으며, 그 정제율은 35배였고, 수율은 36.6%였다. 본 효소는 여러 탄수화물들 중에서 β-1,3-glucan인 laminarin과 curdlan만을 기질로 사용하였으며, 최종 생성물이 oligosaccharide인 것으로 보아 반응 형태는 endo-type일 것으로 추정된다. 효소의 생화학적 특성은 두 기질에 대해 일치하는 결과를 나타내었다. 효소 활성의 최적 pH는 5.0, 최적 온도는 55℃로 나타났으며, 효소의 활성화 에너지(Ea) 값은 laminarin과 curdlan을 기질로 했을 때, 4.74 kcal/mol과 5.28 kcal/mol이었다. 효소는 pH 4.0에서 7.0사애의 범위에서 가장 안정하였으며, 온도는 40℃까지는 안정하였으나, 55℃에서 10분간의 열처리에서는 완전히 불활성화되었다. 효소적 열안정성에서 CaCl₂를 첨가했을 때, 그 안정성이 훨씬 증가하였다.
Laminarin과 curdlan을 기질로 한 효소의 Michaelis-Menten상수는 각각 4.76mg/mL와 15.15mg/mL였다. 그리고, Fe^(2+)와 Cu^(2+)같은 금속 이온에 의해 효소 활성이 저해되었으며, EDTA첨가서 Fe^(2+)와 Cu^(2+)에 의한 저해가 회복되는 경향을 보였다. N-Bromosuccinimide도 효소 활성을 강력하게 저해하였으며, 반면 solfhydryl시약은 효소 활성을 촉진시켰다.
Bacillus sp.으로부터 생성된 β-1,3-glucanase의 효모 세포벽 용해는 cup-plate test를 통해 확인되었다. Baker's yeast cell의 현탁액에 dithiothreitol과 β~mercaptoethanol을 첨가했을 매, 그 용해율이 증가하였으며, 생효모(Saccharomyces cereuisiae) 세포벽 용해의 조건으로는 dithiothreitol첨가시, 최적 pH는pH 6.0, 최적 온도는 50℃였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

A bacterium capable to produce β-1,3-glucanase(E.C.3.2.1.39) was from soil and identified as a strain of Bacillus sp. The effects of medium compositions and culture condition on β-l,3-glucanase production from Bacillus sp. were investigated. Among tested carbon sources, curdlan(β-1,3-glucan) was the most effective for production of the enzyme, whereas mono- and di-saccharides were generally ineffective. Therefore the enzyme seems to be induced when β-1,3-glucan was used as the sole carbon source. The optimum concentration of curdlan for the enzyme production was found to be 7.5%. Among tested nitrogen sources, baker's yeast cell was the best for the enzyme production. The enzyme seems to be repressed by the presence of glucose. The effect of the culture condition on β-1,3-glucanase production from Bacillus sp. was investigated. The enzyme was maximally produced by cultivating the organism at medium of initial pH 6.0 at 32℃.
The β-1,3-glucanase was partially purified by ethanol precipitation, Sephacryl S -200 gel filtration and DEAE-Sephacel ion-exchange chromatography. The enzyme was purified 35-fold and yielded 36.6%. Among the various carbohydrates tested the enzyme used only laminarin and curdlan as a substrate. 'The final product of enzyme reaction was identified as oligosaccharide, therefore the mode of the enzyme action seems to be an endo β-1,3-glucanase of a oligosaccharide-producing type. e biochemical characterization of the enzyme has similar results on two substrates. The optimum pH and temperature on the enzyme activity were 4.5 and 55℃, respectively. The activation energy of enzyme was identified as 4.74 kcal/mol for larninarin and 5.28 kcal/mol for curdlan, respectively. The enzyme was stable at pH ranges from 4.0 to 7.0, and completely inactivated when incubated above 55℃ . The thermostability of the β-1,3-glucanase treated with CaCl_(2) was increased to a greater extent. The K, values of the enzyme for laminarin and curdlan were determined to be 4.76 and 15.15 mg/mL, respectively. The enzyme was inhibited by metal ions such as Fe^(2+) and Cu^(2+), while enzyme activity was recovered from the inhibition of Fe^(2+) and Cu^(2+) by the addition of EDTA. Tryptophan specific reagent, N-bromosuccinimide(NBS), completely inactivated the enzyme, whereas sulfhydryl reagents increased the enzyme activity slightly.
Lytic activity of the β-1,3-glucanase from Bacillus sp. was determined by observing clear zone in an agar plate with viable yeast cell (cup-plate test). The addition of dithiothreitol and β-mercaptoethanol to the baker's yeast cell suspension enhanced the lytic activity of the enzyme. The optimal pH and temperature for the lysis of viable yeast cells were identified as pH 6.0 and 50℃, respectively.

목차 (Table of Contents)

• 목차 = ⅲ
• Ⅰ. 서론 = 1
• Ⅱ. 실험재료 및 방법 = 15
• 1. 시약 = 15
• 2. β-1,3-Glucanase생산균주의 분리 및 동정 = 15
• 3. β-1,3-Glucanase활성의 측정 = 16
• 4. 균의 형태적 특성 = 18
• 5. 균의 생화학적 특성 = 19
• 6. Thin Layer Chromatography(TLC) = 19
• 7. Bacillus sp.의 β-1,3-glucanase의 생성 조건 = 19
• 8. 단백질정량 = 21
• 9. 환원당정량 = 23
• 10. 효소의 정제 = 23
• 11. 효소학적 특성 = 25
• 12. Saccharomyces cerevisiae의 배양 = 29
• 13. Saccharomyces cerevisiae의 세포벽 용해 활성 측정 = 29
• 14. 효모 세표벽 용해의 최적 조건 = 30
• Ⅲ. 결과 및 고찰 = 34
• 1. β-1,3-Glucanase생산균주의 분리 = 34
• 2. 균주의 동정 = 34
• 3. Thin Layer Chromatography = 34
• 4. Bacillus sp.의 β-1,3-glucanase의 생성 조건 = 36
• 가. 탄소원의 영향 = 36
• 나. 질소원의 영향 = 36
• 다. Glucose의 농도별 영향 = 40
• 라. 초기 pH의 영향 = 45
• 마. 배양 온도의 영향 = 45
• 5. 효소의 정제 = 45
• 6. 효소학적 특성 = 51
• 가. 최적 pH와 pH안정성 = 51
• 나. 최적 온도와 열안정성 = 51
• 다. 열안정성에 대한 CaCl_(2)의 영향 = 57
• 라. 금속 이온 및 각종 화합물의 영향 = 62
• 마. 기질특이성 = 66
• 바. Kinetic Properties = 66
• 7. 효모 세포벽 용해의 최적 조건 = 70
• 가. 생효모 세포의 용해 = 70
• 나. β-Mercaptoethanol과 Dithiothreitol의 영향 = 70
• 다. Dithiothreitol의 농도별 영향 = 70
• 라. 반응 시간별 영향 = 75
• 마. pH의 영향 = 75
• 바. 반응 온도의 영향 = 78
• 참고문헌 = 80
• ABSTRACT = 89