인삼잎으로부터 분리한 ginsenoside류의 생리활성 및 생물전환 = Physiological activity biotransformation of ginsenosides isolated from ginseng leaves.

국문 초록 (Abstract)

인삼의 생산과정 중 대부분 폐기되어 왔던 인삼잎의 새로운 이용성을 모색할 목적으로, 인삼잎으로부터 열수추출 및 HP-20 chromatography를 거쳐 고 ginsenoside 함유 획분, GL-1을 분리하였다. GL-1의 일반성분을 분석한 결과, 조사포닌은 58%이었으며 중성당, 단백질 및 산성당함량은 각각 31.82, 5.98과 4.20%였다. 또한 GL-1을 구성하고 있는 ginsenoside류의 성분을 HPLC로 분석한 결과, protopanaxatriol계인 Re가 34.42%로 가장 높은 함량을 보였으며 Rg1과 protopanaxadiol계인 Rc 및 F2가 각각 20.73, 18.42와 8.6%순으로 분석되었다. GL-1의 ABTS, superoxide anion 라디칼 소거능 및 ferrous ion 킬레이팅 효과는 5,000 µg/mL의 농도에서 각각 75.14, 75.65와 75.12%로 50%이상의 매우 높은 항산화활성을 보였으며, DPPH 라디칼 소거능은 10,000 µg/mL의 농도에서 39%의 활성을, nitric oxide 및 hydroxyl 라디칼 소거능은 1,000과 10,000 µg/mL의 농도에서 각각 53.51과 52.73%의 활성을 보였다. 한편 인체의 초기면역반응에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 보체계에 대한 활성화능은 500, 1,000 및 2,000 µg/mL의 농도에서 각각 13, 18 및 22.5%로 농도 의존적 활성증가 경향을 보였으나 양성대조군인 PSK보다는 낮은 활성이었다. 또한 GL-1은 Ca⁺⁺가 제거된 상태에서의 항보체 활성과 anti-human C3를 이용한 2차원 면역 전기영동의 결과로부터 classical 및 alternative pathway 양 경로를 경유하여 보체계를 활성화함을 확인할 수 있었다. 인삼잎으로부터 분리된 고 ginsenoside 획분, GL-1의 인체 내 흡수율을 높이고자 유기산 처리 및 분리균주를 이용한 GL-1 발효물을 각각 제조한 후 GL-1 중의 ginsenoside류의 고 흡수체로의 전환을 관찰하였다. 0.1%의 lactic acid와 acetic acid를 처리한 결과 비교 두 처리군 모두에서 반응시간이 증가함에 따라 ginsenosides Rc, Rb1, Rg1, Re, Rc, Rd, Rb2 및 compound K는 감소하는 경향을 보인 반면, ginsenosides Rh1+Rg2(s), Rg2(r), F2, Mc, Rf, Rg3, Rk1과 Rh2는 증가하는 경향을 보였다. 1% lactic acid와 acetic acid를 처리한 결과 반응 5시간 동안 Rf를 제외한 모든 ginsenosides의 분획은 반응시간이 증가함에 따라 감소하는 경향을 보였다. 결과적으로 인삼잎으로부터 분리된 GL-1을 0.1과 1%의 lactic acid 및 acetic acid로 산 처리한 결과 모든 처리 군에서 최종 대사체인 compound K와 Rh2의 전환은 모두 일어나지 않았으나 중간대사체인 0.1% lactic acid처리시 Mc, F2와 Rg3로의 최대 전환율을 보였다. 한편 홍삼 농축액으로부터 M3, M4 및 P1∼P4의 6개 균주를 분리하고 이를 이용 GL-1을 발효하면서 고흡수 ginsnoside로의 전환율을 추적하였다. Ginsenosides Rg1과 Re는 배양기간이 증가하여도 대부분의 균주 발효물에서 큰 변화를 보이지 않았다. Ginsenosides Rb1과 Rc는 모든 균주발효물에서 배양기간이 증가함에 따라 전반적으로 감소하는 경향을 보인 반면 중간대사체인 ginsenosides Rd와 Mc는 배양기간이 증가함에 따라 GL-1 발효물에서 전반적으로 증가하는 경향을 보였다. 그러나 ginsenoside Mc에 증가율은 Rd의 증가율에 비해 상대적으로 낮은 수준이었다. 최종 대사산물인 compound K는 대부분 GL-1의 발효물에서 배양기간이 증가함에 따라 전반적으로 증가하는 경향을 보였다. 특히 M3와 M4 발효물에서는 발효 전 함량에 비해 약 6배 정도의 증가율을 보였다. 이상의 결과로부터 인삼잎에서 분리한 GL-1획분 중의 ginsenoside류를 분리주 M3 등으로 발효 할 경우, 주로 protopanaxadiol계의 생물전환이 용이하며 인체내 흡수가 어려운 특히 Rb1과 Rc로부터 Rd와 Mc의 중간대사체로 전환된 후 이들 분획들은 다시 흡수가 용이한 최종대사체인 compound K로 최종전환됨을 추정할 수 있었다. 이상의 결과들을 종합해 볼 때 인삼잎으로부터 분리된 고 ginsenoside 획분, GL-1을 이용하여 소화기관 내 흡수율 및 면역 활성이 높은 최종 대사체 compound K로의 생물전환을 위해서는 분리균주 중 M3가 가장 적합한 것으로 판단되었다. 인삼잎 고 ginsenoside 획분, GL-1로 부터 compound K로의 전환능이 우수했던 분리주 M3는 동정을 16S rDNA sequencing을 통해 동정한 결과 Lactobacillus brevis와 99%의 높은 상동성을 확인하였으므로 Lactobacillus brevis 최종 M3로 명명하였다.

목차 (Table of Contents)

• 목 차
• 표목차 ⅳ
• 도목차 ⅴ
• 논문개요 ⅶ
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 실험 재료 및 방법 6
• 1. 실험재료 6
• 2. 실험방법 6
• 2.1. 인삼잎으로부터 ginsenosides 분획의 분리 (GL-1의 제조) 6
• 2.2. 조사포닌 분석 6
• 2.3. 일반성분 분석 7
• 2.4. Ginsenoside 정량분석 8
• 2.4.1. Solid phase extaction에 의한 시료의 전처리 8
• 2.4.2. HPLC를 이용한 ginsenoside 분석 8
• 2.5. 항산화 활성 10
• 2.5.1. 2,2'-Azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonate)(ABTS) 라디칼 소거능 0
• 2.5.2. 1,1-Diphenyl-2-picryl hydrazyl(DPPH) radical 소거능 10
• 2.5.3. Superoxide anion 라디칼 소거능 10
• 2.5.4. Nitric oxide 라디칼 소거능 11
• 2.5.5. Hydroxyl 라디칼 소거능 11
• 2.5.6. 환원력 (Reducing power) 12
• 2.5.7. Ferrous ion 킬레이팅 효과 12
• 2.6. 항보체 활성 13
• 2.6.1. 정상인 혈청(normal human serum, NHS)의 제조 13
• 2.6.2. 보체계 활성화능 측정 13
• 2.6.3. 보체계 활성화 경로 검토 14
• 2.6.3.1. 보체계 활성화 경로 14
• 2.6.3.2. 2차원 면역 전기영동(Crossed Immunoelectrophoresis) 15
• 2.7. GL-1의 ginsenosides 전환 15
• 2.7.1. 산 가수분해 15
• 2.7.2. GL-1의 발효물 제조 16
• 2.7.2.1 홍삼엑기스로부터 균주 분리 16
• 2.7.2.2. GL-1의 발효물 제조 16
• 2.8. 분리균주의 동정 17
• Ⅲ. 실험 결과 18
• 1. GL-1의 조사포닌 및 일반성분 분석 18
• 2. GL-1의 ginsenoside 분석 18
• 3. 인삼잎의 항산화 활성 20
• 3.1. ABTS 라디칼 소거능 20
• 3.2. DPPH 라디칼 소거능 21
• 3.3. Superoxide anion 라디칼 소거능 23
• 3.4. Nitric oxide 라디칼 소거능 24
• 3.5. Hydroxyl 라디칼 소거능 24
• 3.6. 환원력(Reducing power) 25
• 3.7. Ferrous ion 킬레이팅 효과 26
• 4. GL-1의 보체계 활성 27
• 4.1. GL-1의 보체계 활성능 측정 27
• 4.2. 인삼잎의 보체계 활성화 경로의 검토 29
• 4.2.1 인삼잎의 항보체 활성에 미치는 금속이온의 영향 29
• 4.2.2. 2차원 면역전기영동에 의한 보체 활성화 산물의 동정 30
• 5. GL-1에 존재하는 ginsenoside 생체 고흡수 형태로의 전환 32
• 5.1. 산 처리를 이용한 GL-1 ginsenoside 화학적 전환 32
• 5.2. 분리균주를 이용한 인삼잎 고 ginsenoside 획분, GL-1의
• 생물전환 37
• 5.3. 인삼잎의 ginsenoside류로부터 compound K 전환능이 우수한 유산균주의 동정 43
• 참고문헌 45
• Abstract 53