인간 대장암과 췌장암 암세포에서 Δ9-tetrahydrocannabinol과 Cannabichromene에 의한 세포사멸 유도 기작 연구

국문 초록 (Abstract)

최근 여러 분야에서 연구되고 있는 phytocannabinoids는 대마로 알려진 Cannabis sativa에 존재하는 화합물로 Cannabidiol(CBD), Δ9-Tetrahydrocannabinol(Δ9-THC), Cannbinol(CBN), Cannabigerol(CBG), Cannabichromene(CBC) 등 약 113가지 이상이 알려져 있다. 그 중 Δ9-THC는 간질, 진통 효과, 다발성 경화증과 같은 신경 질환, 경직 등에 효능이 있는 것으로 연구되었고 최근에는 항암 효과를 나타내는 것으로 보고된 바 있다. CBC의 경우 다른 cannabinoids에 비해 연구된 바가 적지만 진통 효과에 기여하고 항증식 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 본 연구는 대장암세포인 SW480과 LoVo 세포에서 Δ9-THC에 의한 항암 효과와 췌장암세포인 MIA PaCa-2와 PANC-1 세포에서 CBC에 의한 항암 효과를 평가하였다. Δ9-THC는 대장암세포에서 40 μM 이상의 농도처리 시 성장 억제 효과를 보였고 세포주기에 영향을 미치는 것으로 나타났다. 광학현미경으로 세포를 관찰하였을 때 Δ9-THC 처리 시 세포 내에 형성되는 vesicle이 PPARγ, Clathrin과 같은 소포 수송 유전자 및 단백질에 의해 조절되는 것을 확인했다. 대장암세포에서 Annexin V/PI 분석과 Western blot을 수행한 결과 Δ9-THC는 p53, cleaved PARP-1, caspase 3, 9 등의 세포사멸 단백질의 발현을 조절하여 세포사멸을 유도하였다. 또한 Δ9-THC는 BAX와 BCL-2와 같은 미토콘드리아 막 단백질 조절을 통해 ATP levels를 감소시켰다. MitoTracker staining 시 Δ9-THC는 미토콘드리아 염색 정도와 수를 감소시켰다. 이는 Δ9-THC가 metabolism에도 영향을 미친다는 것을 시사한다. Δ9-THC에 의해 변화한 유전자들은 추가적인 연구가 필요하다고 생각된다. CBC는 췌장암세포에서 30 μM 이상의 농도에서 성장 억제효과를 나타냈고 Δ9-THC와 유사하게 세포 내 vesicle이 형성되는 것을 관찰하였다. 췌장암세포에서 CBC는 세포사멸 단백질 조절에 의한 세포사멸과 대사 감소의 효능을 나타냈다. 이외에도 CBC가 cannabinoid receptor의 agonist로 작용하는 것을 확인하였다. mRNA-seq 결과 췌장암세포에서는 CBC 처리에 의해 여러 유전자들의 발현이 조절되었다. 그 중 유의미하게 변화한 유전자들이 ferroptosis와 관련된 유전자라는 것을 확인했다. Ferroptosis와 관련된 유전자들을 qRT-PCR을 통해 mRNA 발현의 변화를 확인한 결과 CBC 처리에 의해 HMOX1, CHAC1 등 대부분의 유전자들은 발현이 증가하였고 GPX4와 같은 ferroptosis inhibition 유전자의 경우 발현이 유의미하게 변하지 않거나 감소했다. 또한 CBC는 췌장암세포에서 ROS production과 Lipid peroxidation을 증가시켰고 이를 통해 ferroptosis가 유도되는 것을 확인했다. 결론적으로 Δ9-THC와 CBC는 암세포의 세포사멸을 유도하고 세포의 형태학적 변화 및 유전자, 단백질을 조절한다는 것을 시사한다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Phytocannabinoids, which have been studied in various fields in recent years, are compounds found in Cannabis sativa, including cannabidiol (CBD), Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), cannbinol (CBN), cannabigerol (CBG), cannabichromene (CBC). Over 113 types are known. Among them, Δ9-THC has been studied to be effective for epilepsy, analgesic effects, neurological diseases such as multiple sclerosis, and stiffness, and has recently been reported to have anti-cancer effects. In the case of CBC, it has not been studied compared to other cannabinoids, but it is known to contribute to analgesic effects and exhibit anti-proliferative effects. In this study, we evaluated the anti-cancer effects of Δ9-THC in human colorectal cancer cells SW480 and LoVo cells, and the anti-cancer effects of CBC in human pancreatic cancer cells MIA PaCa-2 and PANC-1 cells. Δ9-THC showed a growth-inhibitory effect on colorectal cancer cells when treated at concentrations of 40 μM or higher, and was shown to affect the cell cycle. Observation of the cells with a light microscope confirmed that the vesicles formed within the cells upon Δ9-THC treatment were regulated by vesicle transport genes and proteins such as PPARγ and Clathrin. Annexin V/PI analysis and western blot in colorectal cancer cells showed that Δ9-THC induced apoptosis by regulating the expression of apoptotic proteins such as p53, cleaved PARP-1, and caspase 3 and 9. Furthermore, Δ9-THC reduced ATP levels through modulation of mitochondrial membrane proteins such as BAX and BCL-2. Upon MitoTracker staining, Δ9-THC reduced the extent and number of mitochondrial staining. This suggests that Δ9-THC also affects metabolism. genes altered by Δ9-THC seem to require further study. We observed that CBC exhibited a growth-inhibitory effect on pancreatic cancer cells at concentrations of 30 μM or higher, and intracellular vesicles were formed similarly to Δ9-THC. In pancreatic cancer cells, CBC showed efficacy in reducing cell death and metabolism by modulating apoptotic proteins. Furthermore, we confirmed that CBC functions as an agonist for cannabinoid receptors. Results of mRNA-seq In pancreatic cancer cells, the expression of various genes was regulated by CBC treatment. Among them, the genes that changed significantly were confirmed to be genes related to ferroptosis. When we confirmed changes in mRNA expression of genes related to ferroptosis through qRT-PCR, we found that CBC treatment increased the expression of most genes such as HMOX1 and CHAC1, and in the case of ferroptosis-inhibiting genes such as GPX4, the expression did not change significantly or decreased significantly. We also confirmed that CBC increases ROS production and lipid peroxidation in pancreatic cancer cells, which induces ferroptosis. In conclusion, our results suggest that Δ9-THC and CBC induce apoptosis in cancer cells and regulate cell morphological changes, genes and proteins.

목차 (Table of Contents)

• Ⅰ. General introduction 1
• Ⅱ. Cell death induction and intracellular vesicle formation in human colorectal
• cancer cells treated with Δ9-tetrahydrocannabinol
• 1. 서론 10
• 2. 재료 및 방법 16
• 3. 결과
• 3.1. 인간 대장암 세포에서 Δ9-THC 처리에 의한 세포사멸과 형태학적 변화 19
• 3.2. 인간 대장암 세포에서 Δ9-THC 처리에 의한 세포주기 조절 22
• 3.3. Δ9-THC 처리 시 세포사멸 기전에 관여하는 단백질 조절 24
• 3.4. Δ9-THC 처리에 의한 미토콘드리아 대사 활성 조절 26
• 3.5. Δ9-THC 처리에 의한 vesicle formation 유도 28
• 3.6. PPARγ와 vesicle formation 간의 interaction 30
• 3.7. mRNA sequencing을 통한 유전자 profiling 33
• 4. 결론 및 논의 35
• Ⅲ. Gene expression and ferroptosis induction in human pancreatic cancer cells
• treated with cannabichromene
• 1. 서론 39
• 2. 재료 및 방법 45
• 3. 결과
• 3.1. 인간 췌장암 세포에서 CBC 처리에 의한 세포주기 조절과 형태학적 변화 50
• 3.2. 인간 췌장암 세포에서 CBC 처리에 의한 세포사멸 기전 53
• 3.3. 인간 췌장암 세포에서 CBC 처리에 의한 migration regulation 55
• 3.4. 인간 췌장암 세포에서 CBC 처리에 의한 미토콘드리아 대사 조절 57
• 3.5. CBC 처리에 의한 cannabinoid associated receptor 조절 59
• 3.6. CBC와 CB2 & TRPV1 receptor 간의 interaction 62
• 3.7. mRNA sequencing을 통한 유전자 profiling 65
• 3.8. CBC 처리에 의한 ferroptosis에 관련된 유전자 발현 조절 67
• 3.9. CBC 처리에 의한 HMOX1과 GPX4의 발현 조절 69
• 3.10. CBC 처리에 의한 ferroptosis 유도 72
• 4. 결론 및 논의 74
• Ⅳ. General discussion 77
• Ⅴ. Reference 78
• Ⅵ. 영문초록 91