교모세포종 치료를 위한 초상자성 산화철 나노입자에 의한 대식세포 재분극화에 관한 연구 = Study on Macrophage Repolarization by Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles for Glioblastoma Therapy

국문 초록 (Abstract)

교모세포종 치료를 위한 초상자성 산화철 나노입자에 의한 대식세포 재분극화에 관한 연구 강혜림 신소재공학과 신소재공학전공 국민대학교 일반대학원 서울, 대한민국 교모세포종은 성인에서 발생하는 악성 뇌종양 중 가장 빈번하게 발생하는 종양으 로, 수술, 화학요법, 방사선 요법과 같은 다양한 치료 방법에도 평균 생존율이 낮은 질병이다. 교모세포종은 주위 뇌 조직으로 매우 침습적인 성장을 하는 경향이 있어 종양의 경계가 불분명해 외과적 수술에도 어려움이 있다. 또한, 방사선 요법으로도 완치가 힘들며, 혈액-뇌 장벽 때문에 항암제의 뇌 침투도 어려운 상황이다. 입양 세 포 요법(Adoptive Cell Therapy) 중 하나인 CAR-T세포 치료는 암 환자에게서 T 세포를 직접 채집한 후 암세포를 특이적으로 인식하는 항원 수용체를 달고 다시 환 자에게 재주입하여 정상 세포 손상은 최소화하면서 효과적으로 암세포를 사멸시키 는 면역 치료제이다. 하지만 종양을 특이적으로 인식할 수 있는 항원과 암세포를 죽이도록 지시하는 유전자 편집 기술이 반드시 필요하다는 한계를 가진다. 대식세포는 환경 자극에 반응하여 지속적으로 기능 상태를 변화시킬 수 있는 가 소성이 높은 면역세포이다. 종양 미세환경 내에서 종양 세포와 다른 세포 사이의 상호작용으로 인한 신호가 대식세포를 자극하면, 종양 촉진(M2) 혹은 항종양 반응 (M1)으로의 활성화 상태를 나타낸다. 따라서 본 연구에서는 CAR-T세포 치료의 한 계를 극복하기 위하여, 대식세포를 M1으로 분극 시킬 수 있는 미세환경에 집중하 였다. 산화철 나노입자는 뛰어난 생체 적합성으로 인체의 철 대사 경로에 통합될 수 있 는 물질이다. 본 연구는 대식세포에 산화철 나노입자를 처리하여 전염증성 사이토 카인(cytokine)을 분비할 수 있는 M1 유형으로의 분극화를 유도한다. 대식세포의 재분극화(repolarization)와 식세포 작용을 확인하기 위해 프러시안 블루(prussian blue) 염색을 진행하였다. 또한, 대식세포의 M1 유사 표현형, M2 유사 표현형과 교 모세포종 세포의 페롭토시스를 확인하기 위해 western blot으로 단백질 발현 수치 를 확인하였다. 결과적으로 본 연구는 산화철 나노입자가 잠재적인 항종양 면역요법에 적용될 수 있는 가능성을 확인하였다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Glioblastoma is the most frequently occurring malignant brain tumor in
adults and has a low average survival rate despite various treatment
methods such as surgery, chemotherapy, and radiation therapy. It tends to
grow very invasively into surrounding brain tissue, making surgical
operations difficult as the boundaries of the tumor are unclear. In
addition, it is difficult to completely cure the disease even with radiation
therapy, and it is difficult for anticancer drugs to penetrate the brain due
to the blood-brain barrier. CAR-T cell therapy, one of the adoptive cell
therapies, collects T cells directly from cancer patients, attaches an
antigen receptor that specifically recognizes cancer cells, and reinjects
them into the patient while minimizing damage to normal cells. It is an
immunotherapy treatment that effectively kills cancer cells. However, it
has the limitation that it requires antigens that can specifically recognize
tumors and gene editing technology that instructs cancer cells to be
killed.
Macrophages are immune cells with high plasticity that can
continuously change their functional state in response to environmental
stimuli. When signals resulting from interactions between tumor cells and
other cells within the tumor microenvironment stimulate macrophages,
they exhibit an activation state toward tumor promotion (M2) or
antitumor response (M1). Therefore, this study focused on macrophages
that can overcome the limitations of CAR-T cell therapy by utilizing
activation patterns that vary depending on the surrounding
microenvironment.
Iron oxide nanoparticles are materials that can be integrated into natural
metabolic pathways with excellent biocompatibility. In this study,
macrophages are treated with iron oxide nanoparticles to induce
polarization into the M1 type, which can secrete pro-inflammatory
cytokines. Prussian blue staining was performed to confirm repolarization
and phagocytosis of macrophages. In addition, protein expression levels
were confirmed through western blot to confirm the M1-like and M2-like
phenotypes of macrophages.
As a result, this study confirmed the possibility that iron oxide
nanoparticles can be applied to potential antitumor immunotherapy.

목차 (Table of Contents)

• 제1장 서론 1
• 1.1. 연구의 배경 및 목적 1
• 1.2 교모세포종(Glioblastoma) 3
• 1.3 CAR-T(Chimeric Antigen Receptor-T)세포 치료요법 5
• 1.4 대식세포(Macrophage) 7
• 1.5 페롭토시스(Ferroptosis) 9
• 제2장 초상자성 산화철 나노입자(SPIONs)의 합성 및 분석 11
• 2.1 이론적 배경 11
• 2.2 합성 13
• 2.2.1. 시약 13
• 2.2.2. 합성법 14
• 2.3 특성 분석 17
• 2.3.1. 분석 기기 17
• 2.3.2. X선 회절 분석기 (XRD) pattern 18
• 2.3.3. 투과전자 현미경 (TEM) image 20
• 2.3.4. 유체역학적 크기 분포 (DLS) 22
• 제3장 초상자성 산화철 나노입자(SPIONs)를 이용한 In vitro 실험 24
• 3.1 실험 Scheme 24
• 3.2 Bone marrow derived monocyte(BM0) isolation 26
• 3.2.1. 준비 26
• 3.2.2. Bone marrow derived monocyte(BM0) isolation 방법 27
• 3.3 Cell culture 28
• 3.3.1. 시약 28
• 3.3.2. Bone marrow derived macrophages(BMDMs) 배양 29
• 3.3.3. U87MG-Luc2 배양 30
• 3.4 Cell viability 31
• 3.4.1 MTT assay 31
• 3.5 Prussian blue staining 33
• 3.5.1. 준비 33
• 3.5.2. 염색법 34
• 3.6 In vivo 모사 Transwell 실험 35
• 제4장 실험 결과 및 고찰 37
• 4.1 대식세포의 재분극화(Repolarization) 확인 37
• 4.2 Cell viability 확인 39
• 4.2.1. BMDMs의 MTT assay 39
• 4.2.2. U87MG-Luc2의 MTT assay 41
• 4.3 Prussian blue staining 확인 43
• 4.4 In vivo 모사 Transwell 실험 biomarker 확인 46
• 4.4.1. 대식세포의 M1/M2 marker 확인 46
• 4.4.2. 대식세포의 Polarization pathway marker 확인 48
• 4.4.3 U87MG-Luc2의 Ferroptosis marker 확인 50
• 제5장 요약 및 결론 52
• 참고문헌 53
• 영문 초록 55