돼지 체세포의 조건이 핵이식 수정란의 체외발달에 미치는 영향 = Effects of Donor Cell Condition on In Vitro Development of Nuclear Transplanted Embryos in Porcine Somatic Cell
저자
박희성 (진주산업대학교 동물생명과학과)
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
2002
작성언어
Korean
주제어
KDC
630.5
자료형태
학술저널
수록면
79-89(11쪽)
제공처
본 연구는 복제 돼지의 생산성 향상과 형질전환에 의한 대체장기용 복제 돼지 생산에 기여하기 위한 기초연구로 공여세포의 조건, 핵이식 수정란의 융합 및 활성화, 복제수정란의 체외발달에 미치는 각종 요인들을 조사하였다.
공여세포는 생후 10개월 된 Landrace 종으로부터 귀 세포조직(5×5mm)을 채취하여 0.05%의 trypsin과 EDTA가 첨가된 D-PBS 로 세포를 분리하여 10% FBS가 첨가된 TCM-199 배양액으로 계대배양을 실시하여 사용하였다. 핵이식은 laser system으로 투명대를 drilling 하여 수핵난자의 극체와 핵을 제거한 후 공여세포를 주입하였으며, 핵이식란은 DC 1.9kv/cm, 30μsec 1회의 전기자극으로 융합과 1시간 후 AC 1.50kv/cm, 30μsec 1회의 조건으로 활성화를 실시하여 핵이식란을 분할을 유도하였다. 분할이 이루어진 핵이식 수정란은 10% FBS가 첨가된 NCSU-23 배양액으로 CO2 배양기에서 6∼8일 동안 체외배양을 실시하여 배반포기로 발달한 복제수정란을 Hoechst 33342로 핵염색을 하여 할구수를 조사하였다.
공여세포의 기아배양을 3∼4 및 5∼6 일간 실시하여 핵이식 후 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 45.6 및 36.8%로써 기아배양 기간에 따른 유의적인 차이는 없었다. 융합 및 활성화가 유도된 핵이식란의 분할율은 3∼4일간 기아배양을 실시한 공여세포가 67.1%로써 가장 높게 나타났으며(P<0.05), 5∼6일간 기아배양을 실시한 공여세포의 57.1%와는 유의적인 차이가 없었다. 공여세포를 1∼2, 5∼6 및 13∼14대 계대배양한 것을 사용하여 핵이식 후 전기자극으로 융합을 실시하였을 때 융합율은 52.7, 53.0 및 51.7%로써 계대배양에 따른 유의적인 차이가 없었다. 융합이 이루어진 핵이식란을 융합 후 1시간 뒤에 전기자극에 의한 활성화를 유도했을 때 1∼2, 5∼6 및 13∼14대 계대배양한 공여세포의 분할율도 42.7, 46.8 및 45.5% 로써 유의적인 차이가 없었다. 25μm≥ 크기의 공여세포를 사용하였을 때 핵이식란의 융합율은 65.3%로써 25∼30μm 및 30μm≤ 크기 공여세포의 융합율 42.5 및 45.5% 보다는 유의적(P<0.05)으로 높게 나타났다. 융합과 활성화가 유기된 핵이식란의 분할율은 25μm≥, 25∼30μm 및 30μm≤ 크기에서 각각 56.5, 68.8 및 58.5%로써 공여세포의 크기에 따른 분할율은 유의적인 차이가 없었다. 체외수정란과 체세포 핵이식 수정란의 발달에 있어서는 분할율이 각각 80.1% 와 64.0%로써 핵이식 수정란이 체외수정란 보다 낮았으나, 배반포기로의 발달율에 있어서는 12.4%와 10.5%로써 차이가 없었다. 배반포기 수정란의 할구수는 체외수정란이 28.5 ±2.8 개로써 핵이식 수정란과 단위발생란의 18.6 ±2.1 및 16.0 ±4.0 개보다 유의적(P<0.05)으로 많았다. 이상의 결과를 볼 때 공여세포의 기아배양기간은 3∼6일 정도 실시한 후에 핵이식에 사용하는 것이 융합율과 분할율을 높이는데 바람직하고, 공여세포의 크기는 20∼30μm가 적합하며, 복제 수정란의 발달율을 높이기 위해서는 적정 공여세포의 조건, 융합 및 활성화방법, 배양액 조건 등의 확립이 이루어져야 할 것으로 생각된다.
This study was conducted to examine in vitro developmental ability of porcine embryos after somatic cell nuclear transfer. The porcine ear cell was cultured in vitro for confluency in serum-starvation condition(TCM-199 + 0.5% FBS) for 3∼6 days of cell confluency. The zonae pellucidae of IVM oocytes were partially drilled using laser system. Single somatic cell was individually transferred into enucleated oocytes. And the reconstructed embryos were electrically fused(single DC 1.9kv/cm, 30μsec) with 0.3M mannitol. After electrofusion, embryos were activated(single AC 5v/mm, 5sec) and cultured in NCSU-23 medium containing 10% FBS at 39℃, 5% CO2 in air for 6 to 8 days.
The fusion rate of donor cells was 45.6%, 36.8% and 46.1% in 3∼4, 5∼6 days of serum starvation and non serum starvation(N-S), and were 52.7%, 53.0% and 51.7% in 1∼2, 5∼6 and 13∼14 passages of donor cell culture, respectively. No significant difference was found in the fusion rate of donor cells by the duration of serum starvation treatment or the number of donor cell passages. By the size of donor cells, however, the fusion rate was significantly higher(P<0.05) for reconstructed embryos derived from 25㎛≥ size of donor cells (65.3%) than that of 25∼30㎛(42.5%) or 30㎛(45.5%)≤ cells. The cleavage rate was significantly(P<0.05) higher in 3∼4 days of serum starvation treatment(67.1%) than that in N-S(50.7%) or 5∼6 days of starvation(57.1%). The activation rate by the size of donor cells in fused oocytes was 56.5%, 68.8% and 58.5%, respectively, and was not significant. The developmental rate to blastocyst in nuclear transplanted embryos(10.5%) using somatic cell was similar to IVF embryos(12.4%). The mean number of cells at blastocyst stage was fewer(P<0.05) in nuclear transferred embryos(18.6±2.1 nuclei) than those of in vitro fertilized embryos(28.5±2.8 nuclei). These results suggest that the developmental potential of nuclear transplanted embryos in vitro depends, in part, on suitable culture time and size of donor somatic cells.
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