고려인삼 렉틴 유전자의 클로닝,발현 및 특성에 관한 연구
저자
발행사항
서울: 단국대학교, 2005
학위논문사항
학위논문(석사)-- 단국대학교 대학원: 의학레이저협동과정 생물과학전공 2005
발행연도
2005
작성언어
한국어
주제어
DDC
574.87322 판사항(20)
발행국(도시)
서울
기타서명
Molecular Cloning, Expression and Characterization of Lectin from Panax. Ginseng C. A. Meyer
형태사항
ix,48 장: 삽도; 26cm.
일반주기명
소장기관
렉틴(lectin)은 세포 표면의 당과 특이적으로 결합하는 탄수화물 결합 단백질로서 세포를 응집시키는 능력을 지니고 있다. 렉틴은 생물화학적 및 면역학적 성질이 매우 다양하여 질병의 진단, 치료 및 생명과학 연구의 도구로도 많이 사용되고 있다. 특히 암세포를 응집시킬 수 있는 특성이 알려진 후 많은 관심을 모으고 있다.
본 연구는 인삼잎에서 클로닝된 렉틴 유전자를 이용하여 광역학 치료에 사용되는 광감작제를 조직 특이적으로 전달할 수 있는 기술 개발에 그 목적이 있다. 현재 클로닝된 렉틴 유전자는 351개의 뉴클레오티드로 구성이 되며 116개의 아미노산을 코딩한다. 이는 전체 예상되는 렉틴 유전자의 22%에 해당한다. 밝혀진 렉틴 유전자 서열을 이미 알려진 한국산 겨우살이(Viacum album coloratum), 유럽산 겨우살이(Viscum album agglutinin), 피마자(Ricinus communis), 홍두(Abrus precatorius)의 유전자 서열과 비교한 결과 약 39~43%가 일치하였다. 또한 이들 유전자의 전체 서열을 분석해 본 결과 인삼잎에서 얻은 렉틴은 새로운 종류로 판단된다.
단백질 발현 벡터인 pGEX 4T-1을 사용하여 렉틴 단백질을 과량발현시켰다. 시간대별 렉틴 단백질의 발현양상을 확인해 본 결과 IPTG 유도 후 3시간대에서 가장 잘 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 당특이성을 이용한 친화크로마토그래피분석을 통해 렉틴을 용이하게 분리하고, 발현된 렉틴이 최적의 활성을 나타내는 온도와 pH를 확인하며, 적혈구 응집반응과 그리고 암세포 독성능 실험을 통하여 렉틴의 특징을 규명할 수 있다.
이러한 실험 결과를 바탕으로 향후 FITC나 Texas red와 같은 형광염료(fluorescent dyes)를 렉틴에 결합시켜서 렉틴이 암세포에 특이적으로 형광염료를 전달할 수 있는지 여부를 공촛점 주사 현미경(confocal microscope)으로 관찰함으로써 광역학치료에서 렉틴이 광감작제를 조직 특이적으로 전달하고 더 나아가서는 세포 내부까지 광감작제를 전달할 수 있는지 여부를 규명할 예정이다.
Lectin is a carbohydrate conjugated protein, which specifically combines the cell surface sugar and causes cell agglutination. Several lectins are found and they are different biochemically and immunologically. Lectins can be used for the treatment of diseases, diagnosis, and biotechnological research tools. Recently the researches have been focused on the study of lectin since it has been found that lectin has especially effects on the cancer cell agglutination. The aims of this study is to clone the lectin gene from P. ginseng leaves, to express the lectin in vitro and to use it to deliver the photosensitizer tissue-specifically in photodynamic therapy. First, the lectin gene was cloned from P. ginseng leaves and its nucleotide and amino acid sequences are analyzed. Lectin gene is composed of 351 nucleotide which could encode 116 amino acid. It is corresponded to 22% of the full size of lectin gene. In comparisons of well known lectin gene sequences such as Viscum album coloratum, Viscum album agglutinin, Ricinus communis, and Abrus precatorius, 39 to 43% of identities of nucleotide sequence was observed. Even though the total identities are not that high enough, the lectin gene obtained from P. ginseng in this study is likely to be the new one, because the nucleotide sequences come from different species are compared .
Lectin protein was overexpressed using the expression vector, pGEX 4T-1. It has been verified that the expression level reaches 3 hours after IPTG induction. Lectin protein can be purified directly from P. ginseng leaves using sugar-binding specific affinity column chromatography. The antibody generated against the expressed lectin in E. coli could be useful to identify lectin at the procedures of purification from P. ginseng leaves. Also, its property of hemagglutination and MTT assay could be useful to characterize lectin from P. ginseng leaves.
The expressed lectin protein could be conjugated with fluorescence dyes instead of photosensitizer and examined how it could deliver the fluorescence dye tissue- or cell-specifically in photodynamic therapy. Lectin will be also expected to show its own cytotoxicity as well as the tissue-specific targeting.
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