제주도 야생버섯 근권 토양의 미생물 분리 동정과 메타지놈 분석

국문 초록 (Abstract)

버섯은 천연자원이면서 유전자원이다. 우리 생활과 관련하여서는 식용, 산업용 그리고 의약용으로 이용된다. 자연에서는 생태적으로 중요한 분해자이다. 자연에는 식물과 공생관계에 있는 것에서부터 고사한 목재에 부생하는 것, 생목에 기생하는 것에 이르기까지 다양한 버섯균류가 분포하고 있다. 자연에서 버섯의 생식에 대한 이해는 국내에 자생하는 버섯 자원을 확보하는 데 있어서 중요한 요소이다. 현재 국내 버섯 산업은 그 성장에 비하여 새로운 버섯 자원에 대한 발굴 및 연구는 정체되어있는 상황이다. 이러한 상황을 극복하기 위해 버섯의 생활사에 영향을 미칠 수 있는 다양한 요인에 대한 기초연구가 필요하다.
제주도의 독특한 자연환경은 생물권 보전지역 및 세계자연유산 지정을 통해 국제적으로 가치를 인정받고 있다. 특히 곶자왈 지역의 숲은 보온, 보습 효과가 뛰어나 북방한계 식물과 남방한계 식물이 공존하는 세계 유일한 숲으로 다양한 야생버섯이 서식하는 곳으로 알려져 있다. 이에 따라 본 연구는 버섯이 자라는 자연환경에 대한 기초연구로서 제주도 곶자왈 지역에서 채집된 야생버섯 4종(끈적버섯, 달걀버섯, 색시졸각버섯, 흰알광대버섯)과 곶자왈 근역에서 채집된 야생버섯 4종 (끈적버섯류, 붉은점박이광대버섯, 우산광대버섯, 청머루무당버섯) 등 총 8곳의 근권 토양을 분석하였다. 채집된 야생버섯 근권 토양의 물리‧화학성 분석 결과, 곶자왈 지역의 4곳 버섯 근권 토양은 유기물과 총질소의 양이 비슷하였으나 곶자왈 근역의 4곳 버섯 근권 토양은 채집된 위치에 따라 차이가 있었다. 토성의 경우, 곶자왈 지역 버섯 근권 토양은 미사, 미사질양토인 반면 곶자왈 근역 버섯 근권 토양은 미사질양토, 양토 그리고 사양토이었다. 이들 버섯의 근권 토양 산도는 대부분 약 pH 4 정도이었다. 근권 토양 내 존재하는 세균의 농도는 곶자왈 지역의 경우는 1 x 105 ~ 106 CFU/g, 곶자왈 근역은 1 x 106 ~ 107 CFU/g 로서 다소 차이가 있었다. 진균의 농도는 1 x 104 ~ 106 CFU/g 으로서 두 지역 간에 큰 차이를 보이지 않았다. 8곳 버섯 근권 토양 시료에서 배양법을 이용하여 세균을 분리 동정한 결과 28속 90종이 존재하였다. 문(phylum) 수준에서 분석한 결과 Firmcutes가 59.0% 로 가장 높은 비율을 차지하였고, 다음으로 Proteobacteria 26.27%, Bacteroidetes 22.03% 순으로 높았다. 속(genus) 수준에서는 Paenibacillus가 18.64% 으로 우위를 차지하였고, 다음으로는 Bacillus 15.25%, Paraburkholderia 8.47%, Pseudomonas 와 Streptomyces 7.63% 순으로 존재하였다. 같은 시료로부터 진균을 분리 동정 결과, 42속 76종이 동정되었다. 진균의 문 수준에서는 Ascomycota가 79.79%로서 다수를 차지하였고, 속 수준에서는 Penicillium이 26.6%로서 다수를 차지하였다. 또한 국내에 기록되지 않은 미기록 후보종으로서 12종(A. kogelbergense, C. rosea, D. longisporum, N. cercidis, P. soppii, P. nebulosa, P. nobilis, S. podzolica, Talaromyces sp.1, Talaromyces sp.2, T. album, U. ramanniana)이 존재하였다. 이들 야생버섯 근권 토양에서 분리된 미생물들에 대해 알려진 정보를 문헌에 근거하여 조사한 결과, 자연에서 물질순환의 역할, 식물, 곤충, 인간에 병원성, 항미생물 특성 등을 갖는 미생물들이 존재하였다. 그러나 아직 생물학적 특성이 알려지지 않은 미생물들도 다수 있었다. 버섯 근권 토양에서 분리된 세균 중 10종의 세균이 E. lacerata와 표고버섯균의 균사생육 저해 특성을 보였다. 비배양적 방법인 메타지놈 분석법을 이용하여 버섯 근권 토양의 세균과 진균의 생태적 특성을 조사하였다. 세균의 경우 16S rDNA V3V4 region, 진균의 경우 ITS rDNA region 염기서열을 이용하여 OTUs를 분석하였다. 미생물 군집의 PCoA의 분석 결과, 곶자왈 지역 버섯 근권 토양 내 존재하는 미생물의 종 다양성과 종 풍부도는 유사하였다. 그러나 곶자왈 근역 버섯 근권 토양의 경우에는 채집된 야생버섯 근권 위치에 따라 상당히 달랐다. 세균의 상대적 풍부도 분석 결과, Proteobacteria가 대부분의 야생버섯 근권 토양에서 우점하는 것으로 나타났다. 다음으로는 Acidobacteria가 많이 존재하였다. 속 수준에서는 곶자왈 지역에서 존재하는 세균의 분포가 비슷하였다. 진균의 경우 문 수준에서 상대적 풍부도 분석 결과, Ascomycota가 6곳 지점 버섯 근권 토양에서 우점으로 존재하였다. 그러나 붉은점박이광대버섯과 우산광대버섯 근권 토양에서는 Basidiomycota가 우점으로 존재하였다. 속 수준에서 분석한 결과, 4곳 버섯 근권 토양은 채집 버섯이 속하는 속이 우점으로 존재하였으나, 붉은점박이광대버섯, 우산광대버섯, 흰알광대버섯, 청머루무당버섯의 근권 토양에서는 채집 버섯이 속하지 않는 속이 우점으로 존재하였다. 이러한 결과를 볼 때 야생에서 버섯이 자실체를 형성하는 과정중 토양에서 반드시 우점적으로 존재해야만 하는 것은 아닌 것으로 보여진다. 본 연구를 통해 제주도에 자생하는 8종의 야생버섯의 근권 토양에 대한 물리‧화학성, 미생물 다양성 및 특성, 그리고 생태적 분포 등에 대한 정보를 얻었다. 본 연구 결과는 향후 기후변화에 따른 제주도 지역 야생버섯 자원의 생태와 보존 연구를 위한 기초 자료로 활용될 것으로 기대된다.

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

Mushrooms are natural and genetic resources. In relation to our lives, they are used for food, industry and medicine. They are ecologically important decomposers in nature. Nature has a wide variety of mushroom fungi, ranging from symbiotic relationships to plants, to byproducts of dead wood, and to parasitic life. Understanding of mushroom reproduction in nature is an important factor in securing domestic mushroom resources. Currently, the domestic mushroom industry is in a state of stagnation regarding on research and discovery of new mushroom resources compared to its growth. To overcome this situation, basic research on various factors that can affect mushroom life history is necessary. Jeju's unique natural environment is recognized internationally for its biosphere reserves and World Natural Heritage designations. In particular, the forests in Gotjawal area are known to be home to a variety of wild mushrooms as they are the only forests in the world where northern and southern limit plants coexist with excellent heat retention and moisturizing effects. Accordingly, as a basic study on the natural environment in which mushrooms grow, this study was carried out to analyze rhizosphere soils of eight wild mushroom including four wild mushrooms (Amanita hemibapha, Cortinarius violaceus, Laccaria vinacelavellanea, A. verna) collected in Gotjawal area and other four wild mushrooms (A. rubenscens, A. vaginata, Cortinarius sp., Russula cyanoxantha) collected in Gotjawal nearby area.
The physical and chemical analysis of rhizosphere soils of the collected wild mushrooms showed that the amount of organic matter and total nitrogen was similar in the four mushroom rhizosphere soils of Gotjawal, but dissimilar in the four mushroom rhizosphere soils of the Gotjawal near-by area. The mushroom rhizosphere soils of Gotjawal area were silt and silt loam, while those of the Gotjawal near-by area were silt loam, loam and sandy loam. Acidity of rhizosphere soils of the mushrooms was mostly pH 4. The concentrations of bacteria in the mushroom rhizosphere were slightly different between Gotjawal (1 x 105 ~ 106 CFU/g) and Gotjawal near-by area (1 x 106 ~ 107 CFU/g). Fungal concentrations ranged from 1 x 104 to 106 CFU/g, showing no significant difference between the two areas. Bacteria were isolated from eight mushroom rhizosphere soils by the culturing based method and a total of 90 species of 28 genera were identified. At the phylum level, Firmcutes was the highest with 59.0%, followed by Proteobacteria 26.27% and Bacteroidetes 22.03%. At the genus level, Paenibacillus took the lead with 18.64%, followed by Bacillus 15.25%, Paraburkholderia 8.47%, and Pseudomonas and Streptomyces 7.63%. As a result of identifying fungi from the same samples, a total of 76 species of 42 genera were identified. Ascomycota accounted for the majority with 79.79% at the phylum level and Penicillium accounted for the majority with 26.6% at the genus level. In addition, there were 10 species of unrecorded candidate species (A. kogelbergense, C. rosea, D. longisporum, N. cercidis, P. soppii, P. nebulosa, P. nobilis, S. podzolica, Talaromyces sp.1, Talaromyces sp.2, T. album, U. ramanniana). As a result of examining the known information on the microorganisms isolated from the rhizosphere soils of these wild mushrooms, there were microorganisms having the role of material circulation in nature, pathogenicity to plants, insects and humans, and antimicrobial properties. However, there are many microorganisms whose biological properties are not yet known. Among the bacteria isolated from the rhizosphere soils of mushroom, 10 bacteria species showed inhibition effect on the mycelial growth of E. lacerata and L. edodes. The ecological characteristics of fungi and bacteria in the rhizosphere soils of the mushrooms were investigated using the non-culturing metagenome method. Operational taxonomic units (OTUs) were analyzed using the 16S rDNA V3V4 region sequences for bacteria and internal transcribed spacer (ITS) rDNA region sequences for fungi. As a result of PCoA analysis of microbial community, species diversity and species abundance of microorganisms in Gotjawal mushroom rhizosphere soils were similar in Gotjawal mushroom rhizosphere soils. However, in the mushrooms rhizosphere soils of Gotjawal near-by-area, they differed considerably depending on the location of the mushrooms collected. Relative abundance analysis of bacteria shows that Proteobacteria dominate in the rhizosphere soils of the wild mushrooms. Next, many acidobacteria existed. At the genus level, the distribution of bacteria in the mushroom rhizosphere soils of Gotjawal was similar. The analysis of relative abundance of fungi at the level of phylum, Ascomycota predominantly existed in the rhizosphere soils of six locations where the mushrooms collected. However, Basidiomycota predominantly existed in the rhizosphere soils of A. rubenscens and A. vaginata. Interestingly, the analysis at the level of genus showed that in the five mushroom rhizosphere soils, each sampled mushroom genus predominantly existed. But in the four mushroom (A. rubenscens, A. vaginata, A. verna, and R. cyanoxantha) rhizosphere soils, fungal genera which are different from each of the sampled mushroom genera predominantly existed. These results suggest that not all the wild mushroom genera have to predominantly exist when they are in the process of forming fruiting bodies in the soils. Through this study, scientific data on physical and chemical properties of soils and on the diversity, characteristics, and ecological distribution of microorganisms in the soils were obtained from the rhizosphere soils of eight wild mushrooms growing in Jeju Island. Consequently, it is expected that the obtained data will be used as fundamental data for the ecology and conservation researches of wild mushroom resources in Jeju Island in relation to climate change.

목차 (Table of Contents)

• 국문초록 ⅰ
• 목차 ⅲ
• List of Tables ⅴ
• List of Figures ⅵ
• Ⅰ. 서 론 1
• Ⅱ. 재료 및 방법 3
• 2.1. 제주도 야생버섯의 근권 토양 3
• 2.2. 야생버섯 근권 토양의 물리‧화학성 조사 5
• 2.2.1. 야생버섯 근권 토양의 유기물 분석 방법 5
• 2.2.2. 야생버섯 근권 토양의 전기전도도 분석 방법 5
• 2.2.3. 야생버섯 근권 토양의 총질소 분석 방법 5
• 2.2.4. 야생버섯 근권 토양의 토성 분석 방법 5
• 2.2.5. 야생버섯 근권 토양의 pH 분석 방법 6
• 2.3. 야생버섯 근권 토양의 배양이 가능한 미생물 분리 및 동정 7
• 2.3.1. 세균 분리 및 동정 7
• 2.3.2. 진균 분리 및 동정 9
• 2.4. 야생버섯 근권 토양에서 분리된 세균의 길항미생물 검정 12
• 2.5. 야생버섯 근권 토양의 미생물 군집 분석 14
• 2.5.1. 야생버섯 근권 토양의 미생물 DNA 추출 및 메타지놈 분석 14
• 2.5.2. 야생버섯 근권 토양의 미생물 군집 통계분석 14
• III. 결 과 15
• 3.1. 야생버섯 근권 토양의 물리‧화학성 결과 15
• 3.2. 야생버섯 근권 토양의 미생물 농도 17
• 3.2.1. 야생버섯 근권 토양의 세균 농도 17
• 3.2.2. 야생버섯 근권 토양 내 존재하는 세균 특성 21
• 3.2.3. 야생버섯 근권 토양의 진균 농도 28
• 3.2.4. 야생버섯 근권 토양 내 존재하는 진균 특성 35
• 3.3. 야생버섯 근권 토양에서 분리된 세균의 길항 미생물 검정 결과 41
• 3.4. 야생버섯 근권 토양의 미생물 군집 분석 43
• 3.4.1. 야생버섯 근권 토양의 세균의 군집분석 43
• 3.4.1.1. 세균의 종 다양성 및 종 풍부도 통계분석 43
• 3.4.2. 야생버섯 근권 토양의 진균의 군집분석 49
• 3.4.2.1. 진균의 종 다양성 및 종 풍부도 통계분석 49
• Ⅳ. 고 찰 56
• 참고문헌 60
• (Abstract) 69