한방진단과 치료의 객관화 및 산업화 = Objectification and industrialization of Oriental Medical Prescription
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2004
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Korean
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학술저널
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1-155(155쪽)
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한의학 치료의 주요한 수단인 한방처방의 기초 및 임상효능의 과학적 연구가 매우 절실한 실정이다. 한방처방의 효능의 객관화를 위한 방법으로 다음과 같은 것을 고려해 볼 수 있다. 첫째 복합 처방에 포함되어있는 유효성분을 찾아내고 그 유효성분을 기준으로 표준화해야 하며, 둘째 한방처방에서 밝혀져 있는 약효성분들의 객관적 약리효과와 작용기전을 밝혀야 하고, 셋째 한방처방의 안전성을 확인해야 하며 마지막으로 GCP 기준의 임상시험이 필요하다는 것이다.
본 연구에서는 한방처방을 이용한 치료효능연구에 있어서 위와 같은 문제점들을 해결하고자 다음과 같은 접근방법을 이용하였다. 한방처방의 HPLC profiling에 의한 지표물질분석을 통한 표준화 및 제제학적 안정성 시험을 실시하였으며, 한방처방의 in vitro 및 in vivo 질환모델을 이용한 효력연구 및 작용기전을 연구하였다. 이와 함께 임상시험계획을 작성하고 이들을 아울러서 식품의약품안전청에 임상시험허가(IND)를 신청하였다. 위와 같은 방법론을 활용하여 최종적으로 한방처방의 기준규격과 유효성 및 안전성을 식품의약품안전청으로부터 승인 받고자 하며, 다양한 임상효력이 관찰되고 있는 한방처방의 치료 효능 객관화에 필요한 기본적인 연구의 틀을 확립하고자 한다.
본 연구에서는 한방처방 YM의 안정성시험을 실시하고, HPLC-DAD 활성성분을 정성분석하였으며, 표준화된 처방에 대한 항산화 활성의 측정, 동물 세포에서 탕제의 항산화 효과, 탕제 투여된 동물 조직에서의 항산화 활성 중강 효과, AAPH로 산화적 손상을 유발한 흰 쥐에서 탕제의 보호 효과, 뇌신경세포의 허혈성 손상에 대한 효과, 4-vessel occlusion 모델에서 보호효능 연구, MCAo 모델에서 보호효능 연구 등을 연구하였다.
한방처방 YM의 안정성시험
YM은 실온에서 24 개월 동안 전 시험항목(성상, 확인시험, 함량시험, pH 시험, 미생물 허용시험, 보존제시험, 질량편차시험, 중금속시험)에서 어떠한 이상도 관찰되지 않았으며 특히, 함량 시험 항목에서는 주성분인 패오노플로린의 함량은 초기와 비교해 볼 때 변화가 거의 미비한 것으로 나타났다. 이 결과를 통해 YM은 보관 조건인 실온조건에서 24 개월 동안 매우 안정한 제제임을 알 수 있었으며, 향후 안정성시험을 계속 진행하여 제품의 유효기간을 24 개월 이상으로도 연장할 수 있을 것이라 사료된다.
한방처방 YM의 HPLC-DAD 분석
YM 중 지표성분을 HPLC를 이용하여 분석하였으며 이들은 5-HMF, loganin, paeoniflorin, paeonol로 각각 확인하였다.
한방처방 YM의 투여에 의한 생체내 항산화 보호능 증가효과 연구
YM이 in vitro, in vivo실험에서 모두 비교적 높은 항산화 능력을 보여주었고 특히 뇌조직에서 높은 항산화 방어능력을 가진 것으로 관찰되었다.
뇌신경세포의 허혈성 손상에 대한 한방처방의 효과 연구
뇌혈관 질환중 하나인 중풍은 허혈성과 출혈성으로 구분되며, 허혈성 중풍은 산소 결핍 상태인 hypoxia와 영양분 결핍 상태인 hypoglycemia가 대표적 상태로 나타낸다. A172와 SK-N-MC 세포주를 이용한 조건 검색에서 glucose-free media 및 95% N2/5% CO2 대기 환경에서 8시간 배양한 후 다시 정상적인 환경에서 24시간 추가배양함으로서 산화적 손상의 중가 및 세포 사멸, xanthine oxidase 활성 증가등을 관찰할 수 있어 허혈상태를 의태하였다고 판단되었다. 이 같은 조건에서 YM은 자체 항산화력이 높은 것으로 나타났다.
저산소상태에서 한방처방의 뇌신경세포 보호효과에 대한 연구
In vitro 환경에서 인간의 뇌허혈성 중풍을 의태할 수 있다고 생각되는 허혈/재관류 모델을 사용하여 중풍 발생시 산화적 손상과 더불어서 뇌조직에 심각한 손상을 주는 하나의 인자로 추측되는 염증 반응에 대한 한방처방의 보호효과를 관찰하였다. Human neuroblastoma SK-N-MC cell line을 본 실험에서 사용된 In vitro 허혈/재관류 모델에 적용한 결과 염증 관련 물질인 arachidonic acid, prostaglandin E2 함량 증가 및 이 반응의 중추 효소인 cyclooxygenase-2의 발현양이 증가하는 것으로 관찰되었다. YM을 이 모델에 적용시킨 결과 허혈/재관류 환경하에서 증가되는 arachidonic acid, prostaglandin E2의 함량 및 cyclooxygenase-2의 발현을 억제하였다. YM은 뇌허혈성 중풍에서 또 다른 손상 인자인 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 항산화능력이 뛰어난 것으로 나타났기에 항염증능과 항산화능을 동시에 가지고 있어 뇌허혈성 중풍에 좋은 효과를 보일 것으로 추측된다.
뇌허혈 동물모델에서 한방처방의 효과 연구
In vitro에서 허혈/재관류 상태에서 세포보호 효능과 항산화효과가 뛰어난 YM을 4-vessel occlusion에 의해 유발된 global ischemia의 동물모델과 MCA occlusion 중풍 동물모델에 투여함으로써 신경방어효과를 확인한 결과 뇌허혈로부터 신경세포에 대한 보호효과가 우수한 것으로 관찰되었다.
한방처방 YM의 임상시험계획 및 IND 신청
본 연구에서는 전임상 연구에서 효력이 입증된 한방처방 YM의 효력을 GCP 기준의 임상시험을 통하여 궁극적으로 입증하기 위한 임상시험을 계획하였다. 임상시험 피험자수를 산출하였고 효력평가 지표로 양방지표인 NIHSS, MBI, SSQOL과 더불어 한방지표로 한 국형중풍변증지표와 신허지표를 포함시켰다. 이와 같은 연구 결과를 토대로 2004년 12월 8일 식품의약품안전청에 의약품임상시험 허가(IND)를 신청 하였다.
활용계획
본 연구에서 작성된 임상시험계획이 식약청의 승인을 받아 GCP 기준의 임상시험이 성공적으로 완료되어 한방처방의 유효성과 안전성을 공식적으로 인정받게 될 것이다. 본 연구는 향후 한방치료효능의 궁극적인 객관화에 필요한 연구의 틀을 제공할 수 있을 것으로 보인다.
For the development of drug using herbal preparations, chemical analysis of complex crude drugs, elucidation of drug action by molecular biology and statistical method of clinical study must carry out.
Oriental medical prescription, YM, is used for tinnitus, amnesia, soreness of loins, impotence and dizziness due to deficiency of (?m(Yin) of the kidneys and it is big pill of six ingredients with Rehmanniae Radix Preparata, Corni Fructus, Dioscoreae Rhizoma, Alismatis Rhizoma, Hoelen and Moutan Cortex Radicis. It is currently the most representative Hanyak medicine (traditional Korean medicine). However, very little has scientific investigation been carried out.
YM is prepared from the hot water extraction of six raw materials, therefore many kinds of constituents are included. Three-dimensional (3D) HPLC analysis is useful for obtaining many kinds of constituents, especially low molecular ultraviolet (UV) quenching compounds, contained in YM. Fingerprint pattern provided by 3D HPLC analysis makes possible to identify the overall-viewing of YM. Studies using HPLC DAD have found that YM contains four major low molecular compounds (i.e. 5-HMF, loganin, paeoniflorin, plaeonol), These compounds have various pharmacological actions, and are assumed to be responsible, at least partly, for the pharmacological effects of YM.
For the stability, the YM kept it in room temperature for 24 months. And an appearance, identity test, content of marker substances, pH, contamination test, preservation, variation of mass, a heavy metal test, what kind of problem was not observed. Specially, a content of the paeoniflorin which was marker substance of YM compared with the early days and was changeless.
The free radical theory proposed by Harman postulates that free radical-induced oxidative damage contributes to the stroke. In this research, YM was investigated for in vitro and in vivo antioxidative potentials. Antioxidative potential were evaluated by DPPH(1, l-diphenyl-2-picrylhydrazyl) radical quencing capacity, inhibition of pyrogallol auto-oxidation and peroxyl radical scavenging activity. YM showed relatively high scavenging activity of free radicals. When chick red blood cell cells, were exposed to AAPH (2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride), YM was found to significantly inhibit hemolysis, decrease SOD. Antioxidative potentials of these three herbal medicine were also investigated by in vivo experiment. In the brain and liver tissue of mice treated with AAPH, YM is decreased TBARS formation and protein degradation which are used as index of oxidatve stress, and increased total antioxidant status and glutathione level. However, activity of antioxidative enzyme such as SOD, catalase and glutatione peroxidase, did not seemed to be influenced by these herbal medicines. From these result, it can be assumed that water-soluble extracts of YM have antioxidative potential and thereby protect cells against oxidative stress. However, increased antioxidative potentials found in mice treated with herbal medicine seems to be not related to the modulate of antioxidative enzyme activity but related to antioxidative potentials of YM itself.
The Oxygen and glucose deprivation(OGD) provides an excellent preparation for examining the mechanisms of hypoxic brain damage and for rapid testing of neuroprotective drugs. After damage for 20 min OGD condition, the extract of YM siginificantly decreased the arachidonic acid, prostaglandin E2, Cox-2 induced by hypoxic injury. This result indicates that the YM extract can exert the protective effect on hypoxic-ischemia demage.
The neuroprotective effect of the YM extract on the ischemia model of rat caused by 4-VO and MCAo allowed the following conclusions to be obtained.
Under the conditions of controlling the body temperature after the induction of cerebral ischemia by 4-VO, the YM extract(300mg/kg) protected the damage of neuronal cells upon the induction of cerebral ischem
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