魚具類中에 分布하는 蛋白質分解酵素의 分離 및 精製에 關한 硏究 = Purification and Characterization of Proteolytic Enzymes Isolated from Marine Animals
저자
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
1986
작성언어
Korean
KDC
529.000
자료형태
학술저널
수록면
123-139(17쪽)
제공처
水産無脊椎動物중 낙지, 전복, 소라, 군소, 해삼, 개불과 水産脊椎動物인 말쥐치, 두툽상어, 먹장어, 고등어 그리고 정어리의 消化管 및 肉과 臟器組織을 區分하여 組織中에 分布하는 蛋白質分解組酵素를 抽出하여 그 活性을 比較·檢討하였다. 그리고 强한 活性을 보인 고등어 幽門垂에서 抽出한 粗酵素는 鹽析, DEAE-Sephadex A-50 column chromatography 및 Sephades G-100 겔여과에 의하여 3種類의 알칼리性 蛋白質分解酵素를 分離·精製하였으며 各 精製酵素에 대하여 活性最適條件, 基質親和度, 化學藥劑에 의한 影響 및 分子量 등을 究明하였다. 그리고 試料動物의 內臟에서 分離한 細菌中에서 가장 强한 蛋白質分解酵素를 生産하는 菌株를 選別하고 그 菌이 生産한 酵素를 精製하여 特性을 調査한 結果를 要約하면 다음과 같다.
1. 各 試料의 組織에서 抽出한 粗酵素中 活性이 强한 것으로는 정어리의 膵臟에서 抽出한 것이 活性最適條件인 pH 9.8, 45℃에서 固有活性은 360 이었고, 고등어 幽門??에서 抽出한 것은 pH 9.4, 45~50℃에서 固有活性은 275였다.
2. 고등어 幽門垂에서 抽出한 粗酵素에서는 3種의 알칼리性 蛋白質分解酵素가 分離·精製되었는데, 이 세 酵素를 SDS-PAG 電氣泳動法과 Se-phadex G-100겔 여과법에 의하여 分析·檢討한 結果 이들 酵素는 모두 monomeric polypeptide로서 구성되고, 分子量은 Enz. A가 27,500, Enz. B가 20,500, 그리고 Enz. C가 15,250 정도였다.
3. 酵素의 基質親和度를 測定한 結果 Km値는 casein 基質에 대하여 Enz. A는 5.0×??, Enz.B는 1.0×?? 그리고 Enz. C는 3.3×??였다.
4. 各 精製酵素는 soybean trypsin inhibitor에 의하여 活性이 沮害를 되었으며 Enz. A는 p-chloromercuribenzoate에 의해서도 沮害를 받았는데 Enz. B와 C는 serine系 蛋白質分解酵素로 判斷되었다.
5. 分離細菌中에서 제일 강한 蛋白質分解酵素를 生産하는 細菌은 Pseudomonas SPP. 였으며 酵素의 生産은 pH 7.0, 溫度 25℃, 食鹽 0.5% 염화칼슘 0.2%를 添加했을 때 제일 양호하였으며, 이 酵素는 分子量이 약 29,000되는 metal chelator sensitive neutral proteinase로 추정되었다.
6. 結論的으로 漁具類의 組織酵素는 계속적인 原料供給이 어려우므로 酵素의 産業的 利用을 위해서는 細菌이 生産한 菌體外 蛋白質分解酵素의 活用이 보다 有益할 것으로 생각된다.
Proteolytic actvity of the tissue extracts from the octopus(Octopus variabilis), abalone (Haliotis discus hannai), top shell(Turbo cornutus), sea hare(Aplysia kurodai), sea cucumber(Stichopus japonicus), echiurid(Urechis unicinctus), file fish(Navodon modestus), cat shark(Scillion hinus tarazame), hag fish(Eptatretus burgeri), mackerel(Scomber japonicus) and sardine(Sardinops melanosticta) was compared to develope as an useful enzyme.
The strongest proteolyticbacterium was selected among the isolated strains from the samples submitted, then the proteolytic exoenzyme produced by this strain was also characterized.
Among the tissue enzyme extracts, the proteolytic enzymes from the pyloric caeca of mackerel and pancreas of sardine were estimated as strong alkaline proteinases. The optimum pH and temperature of the crude enzyme extracted with 1% NaCl from the pyloric caeca of mackerel and pancreas of sardine were pH 0.4, 50℃ and pH 9.8, 45℃, respectively. Specific activity of the former enzyme was 275 nM-Tyr. eq/mg-protein/min and that of latter one was 360 nM-Tyr. eq/mg-protein/min.
Three kinds of alkaline proteinases were isolated from the pyloric caeca of mackerel, we named those as enzyme A, B and C. Molecular weight of enzyme A, B and C determined by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Sephadex G-100 gel filtration method was to be 27,500, 20,500 and 15,250, respectively. Km value of enzyme A, B and C by the method of Lineweaver and Burk was determined to be 5.0×10??%, 1.0×10??% and 3.3×10??%, respectively, for 2% casein solution as a substrate.
According to the analytical results, these enzymes were observed to be composed of monomeric polypeptide. The enzyme B and C were supposed to be a serine protease because these enzymes were remarkbly inhibited by soybean trypsin inhibitor.
Pseudomonas spp. (named Pseudomonas FU 101) was identified as the strongest proteolytic bacterium among the isolated strains, which grew best at 25℃, pH 7.5.
It is observed that the addition of 0.2% CaCl₂ and 0.5% NaCl in the culture medium was benefitted for the production of proteinase by Pseudomonas FU 101. The extracellular proteinase produced by the strain was supposed to be kind of metal chelator sensitive neutral protease, and it showed maximum activity at 35℃, pH 7.0. Molecular weight was estimated to be 29,000 by gel filtration.
As a conclusion, both proteinases produced by Pseudomonas FU 101 and extracted from tissue of mackerel were pretty good in enzyme activity, but bacterial enzyme was more benefit for industrial use than the enzyme of mackerel tissue, because it is very difficult to supply continuously lots of pyloric caeca of mackerel as raw material for enzyme extraction.
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