SCOPUS
SCIE
Key amino acid residues conferring enhanced enzyme activity at cold temperatures in an Antarctic polyextremophilic β-galactosidase
저자
Laye, Victoria J. ; Karan, Ram ; Kim, Jong-Myoung ; Pecher, Wolf T. ; DasSarma, Priya ; DasSarma, Shiladitya
발행기관
학술지명
PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA -
권호사항
발행연도
2017
작성언어
-주제어
등재정보
SCOPUS,SCIE
자료형태
학술저널
수록면
12530-12535(6쪽)
제공처
<P><B>Significance</B></P><P>Combining comparative genomics, mutagenesis, kinetic analysis, and molecular modeling provides a powerful way to explore and understand the structure and function of proteins under extreme and potentially astrobiological conditions. Alignment of closely related cold-active and mesophilic β-galactosidase enzymes from halophilic Archaea, followed by mutagenesis and kinetic analysis, demonstrates the importance of specific amino acid residues in temperature-dependent catalytic activity, while molecular modeling provides a structural framework for their mechanism of action. Such an interdisciplinary approach shows how a very small fraction of conserved residues that are divergent from mesophilic homologs are key to enhancing catalytic activity at cold temperatures and underscores the power of combining genomics and genetics with biochemistry and structural biology for understanding polyextremophilic enzyme function.</P><P>The Antarctic microorganism <I>Halorubrum lacusprofundi</I> harbors a model polyextremophilic β-galactosidase that functions in cold, hypersaline conditions. Six amino acid residues potentially important for cold activity were identified by comparative genomics and substituted with evolutionarily conserved residues (N251D, A263S, I299L, F387L, I476V, and V482L) in closely related homologs from mesophilic haloarchaea. Using a homology model, four residues (N251, A263, I299, and F387) were located in the TIM barrel around the active site in domain A, and two residues (I476 and V482) were within coiled or β-sheet regions in domain B distant to the active site. Site-directed mutagenesis was performed by partial gene synthesis, and enzymes were overproduced from the cold-inducible <I>csp</I>D2 promoter in the genetically tractable Haloarchaeon, <I>Halobacterium</I> sp. NRC-1. Purified enzymes were characterized by steady-state kinetic analysis at temperatures from 0 to 25 °C using the chromogenic substrate <I>o</I>-nitrophenyl-β-galactoside. All substitutions resulted in altered temperature activity profiles compared with wild type, with five of the six clearly exhibiting reduced catalytic efficiency (<I>k</I><SUB>cat</SUB>/<I>K</I><SUB>m</SUB>) at colder temperatures and/or higher efficiency at warmer temperatures. These results could be accounted for by temperature-dependent changes in both <I>K</I><SUB>m</SUB> and <I>k</I><SUB>cat</SUB> (three substitutions) or either <I>K</I><SUB>m</SUB> or <I>k</I><SUB>cat</SUB> (one substitution each). The effects were correlated with perturbation of charge, hydrogen bonding, or packing, likely affecting the temperature-dependent flexibility and function of the enzyme. Our interdisciplinary approach, incorporating comparative genomics, mutagenesis, enzyme kinetics, and modeling, has shown that divergence of a very small number of amino acid residues can account for the cold temperature function of a polyextremophilic enzyme.</P>
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