Coxiella burnetii에 대한 항체의 검출을 위한 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay의 정립 = Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Antibodies to Coxiella burnetii
본 연구에서는 지금까지 진단이 내려지지 않았던 C. burnetii 감염증 환자들을 보다 빠르고 간편하며 정확하면서도 대량으로 검사할 수 있는 방법으로서 C. burnetii 단백항원을 이용한 효소면역측정법을 정립하고자 하였다. 본 실험에서 정립한 효소면역측정법은 간접 방법으로서 C. burnetii phase I에 대한 IgG를 검출하기 위해 고안되었다. C. burnetii 단백질 항원의 적정 농도는 야성 대조혈청의 흡광도와 음성 대조혈청에서의 흡광도의 차이가 가장 크게 나는 농도인 1ug/ml을 적정항원농도로 결정하였으며, 검사 혈청의 적정희석 농도도 역시 양성대조항원의 OD 값과 음성대조항원에서의 OD값의 차이가 가장 크게 나면서 비교적 background activity가 적은 혈청의 희석 농도인 1:300을 적정 혈청 희석 농도로 결정하였다. 이 때 각각의 야성 혈청이 0.185의 흡광도를 가질 수 있는 가장 높은 혈청 희석 농도의 로그값과, 같은 혈청을 1:300으로 희석했을 때의 흡광도 사이에 상관계수 r값이 0.95인 직선적 관계가 성립하여, 하가지 혈청 희석 농도(1:300)에서 결정된 ELISA값이 그 혈청의 항체가를 양적으로 표시하였다.
효소면역측정법의 양성 판정 기준은, IFA에서 C. burnetii에 대한 항체가 음성으로 확인된 혈청 100개를 대상으로 ELISA를 시행하여, 이들의 흡광도의 산술평균치와 표준편차를 구한 결과, 신뢰구간 95%에서 최고치인 0.185를 ELISA 야성 판정의 기준인 cut-off value로 정하였다. 위애서 정한 기준에 의해 ELISA를 시행하엿을 때, IFA에서 양성으로 판명된 혈청 모두에서 양성으로 나타나 민감도가 매우 높은 것으로 나타났다.
다음으로 ELISA 방법의 특이도를 조사하기 위해서, IFA 검사에서 음성으로 확인된 혈청(혈청 희석 농도 1:10에서 음성)을 대상으로 ELISA를 시행한 결과, blocking agent로서 1% BSA를 사용했을 때는 9.3%, 5% NGS는 11.3%, 그리고 blocking을 전혀 하지 않았을 때는 15.3%의 위양성율을 나타내어, BSA와 NGS 상이에는 통계학적으로 차이가 없었으나, blocking을 하지 않는 것 보다는 하는 것이 위양성율이 적은 것으로 나타났다. 그러나, 이것은 어디까지나 IFA기준이며, 절대적인 의미에서의 위양성율을 의미하는 것은 아니다. 결론적으로 본 연구에서 정립한 효소면역측정법은 매우 높은 민감도를 갖고 있으므로 Q fever가 의심되는 환자를 screening하기 위한 적절한 방법으로 사료된다.
Currently, the indirect immunofluorescence assay(IFA) is used for detecting antibodies to Coxiella burnetii. Although reliable, this method is time-consuming, and the results are subject to interpretation. To develop an alternative test, we used an enzyme-linked immunosorbent asssy (ELISA) because it was faster, less complicated, and more objective than the IFA. The ELISA, unlike the IFA, can also be automated.
In this study an indirect ELISA using C. burnetii protein antigens was developed to detect immunoglobulin G to C. burnetii phase I. A linear relation was found between the logarithms of absorbance values of sera at a dilution of 1/300 and the titres as determined by an end point dilution ELISA. The finding of linear relation (r=0.95) confirmed that an ELISA value determined with a single serum dilution (1:300) can be interpreted quantitatively as the titer of antibody in that serum.
A serum dilution of 1:300 was used in all subsequent tests because at this dilution the difference between absorbance values for positive and negative sera was greatest: a serum sample was regarded as positive if the OD? value was ≥0.185 (absorbance threshold) at this dilution. The results obtained by the ELISA were compared with those by the IFA established already.
The results indicate that the assay provides a sensitive, alternative method for diagnosing Q fever, but it needs reevaluation for the specificity because of its high false-positive rates.
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