Limiting Dilution Assay를 이용한 Long-term Culture-Initiating Cells의 정량 = Limiting Dilution Assay for Determination of Long-term Culture-Initiating Cells Frequencies
저자
성기웅 (성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 소아과) ; 유경하 (이화여자대학교 의과대학 소아과학교실) ; 고상혁 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 윤계진 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 장필상 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 강형진 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 이준아 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 한효정 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 최형수 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 유은선 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 구홍회 (성균관대학교 의과대학 삼성서울병원 소아과) ; 신희영 (서울대학교 의과대학 소아과학교실) ; 안효섭 (서울대학교 의과대학 소아과학교실, 서울대학교 어린이병원 소아과)
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
1997
작성언어
Korean
주제어
KDC
510.000
자료형태
학술저널
수록면
123-131(9쪽)
제공처
연구배경: LTC-IC는 5주간의 장기액상배양 후에도 집락을 형성할 수 있는 세포를 말하며 조혈모세포의 이식능을 가장 잘 대변할 수 있는 세포이다. 본 연구에서는 Limiting Dilution Assay를 통해 LTC-IC를 정량하고자 하였다.
대상 및 방법: 제대혈, 가동화된 말초혈 및 골수형을 대상으로 일정수의 단핵구에 포함된 CD34^(+) 세포수, CD34^(+)/38- 세포수, 단기배양시 형성된 집락의 수 및 LTC-IC의 수를 구하였다. LTC-IC의 수는 96-well plate에서의 장기액상배양 및 Poisson 분포를 이용한 limiting dilution assay를 이용하였다.
결과: 10^(5)개의 단핵구에 포함된 CD34^(+) 세포, CD34^(+)/38^(-) 세포수는 제대혈에서 960±493, 43.0±20.0, 가동화된 말초혈에서 720±432, 42.5±18.8, 골수혈에서 2,505±805, 805±305였고, CFU-GM의 수는 제대혈에서 24.6±9.9, 가동화된 말초혈에서 20.7±13.0이었고, LTC-IC의 수는 제대혈에서 10.4±5.7, 가동화된 말초혈에서 5.8±5.3, 골수혈에서 13.9±4.2였다.
결론: 96-well plate에서의 장기액상배양 및 Poisson 분포를 이용한 limiting dilution assay를 이용하여 성공적으로 LTC-IC의 수를 정량하였고 이를 통해 이식후의 장기생착능에 대한 정보를 얻을수 있다.
Background: Long-term culture-initiating cells(LTC-IC) are defined as those cells responsible for the presence of clonogenic progenitors in 5-week-old long-term culture. LTC-IC are the best available approximation of stem cells in human. we compared the number of LTC-IC in cord blood(CB), mobilized peripheral blood(PB), and bone marrow(BM) using limiting dilution assay(LDA).
Methods: Samples were obtained from CB, mobilized PB, and BM. Mononuclear cells(MNC) and CD34^(+) cells were separated by ficoll-hypaque centrifugation and method using immunomagnetic beads, respectively. Flow cytometric analysis was done for determination of CD34^(+) and CD34^(+)/38 cells. Clonogenic progenitors were assayed in methylcellulose media. For LDA, MNCs or CD 34^(+) cells were seeded onto irradiated murine stromal feeder layer in 96-well plate at 3~5 different cell concentrations. Wells that did not contain cobblestone area after 5 weeks of culture were counted and the number of LTC-IC was determined using Poisson distribution.
Results: The number of CD34^(+) and CD34^(+)/38^(+) cells per 10^(5) MNCs in CB, PB, and BM were 960±493, 43.0±20.0, 720±432, 42.5±18.8, and 2,505±805, 805±305, respectively. The number of CFU-GM per 10^(5) MNCs in CB and PB were 24.6±9.9 and 20.7±13.0, respectively. The number of LTC-IC per 10^(5) MNCs in CB, PB, and BM were 10.4±5.7, 5.8±5.3, and 13.9±4.2, respectively.
Conclusion: In this report, we successfully determined LTC-IC frequencies using LDA with long-term culture system. Determination of LTC-IC frequencies is useful for measurement of long-term in vivo repopulating potential.
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