KCI등재
Detection of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus using duplex real-time PCR assay with melting curve analysis on fresh lettuce
저자
Lee, Na-Ri ; Kwon, Kyung-Yoon ; Choi, Sung-Wook ; Koo, Min-Seon ; Chun, Hyang-Sook
발행기관
The Korean Society of Food Hygiene and Safety(The Korean Society of Food Hygiene and Safety)
학술지명
권호사항
발행연도
2011
작성언어
English
주제어
등재정보
KCI등재
자료형태
학술저널
발행기관 URL
수록면
114-119(6쪽)
제공처
In this study, two duplex real-time PCR approach with melting curve analysis is presented for the detection of Escherichia coli O157:H7, Listeria monocytogenes, Salmonella spp. and Staphylococcus aureus, which are important food-borne bacterial pathogens usually present in fresh and/or minimally processed vegetables. Reaction conditions were adjusted for the simultaneous amplification and detection of specific fragments in the ${\beta}$-glucuronidase (uidA, E. coli), thermonuclease (nuc, S. aureus), hemolycin (hly, L. monocytogenes) and tetrathionate reductase (ttr, Salmonella spp.) genes. Melting curve analysis using a SYBR Green I real-time PCR approach showed characteristic $T_m$ values demonstrating the specific and efficient amplification of the four pathogens; $80.6{\pm}0.9^{\circ}C$, $86.9{\pm}0.5^{\circ}C$, $80.4{\pm}0.6^{\circ}C$ and $88.1{\pm}0.11^{\circ}C$ for S. aureus, E. coli O157:H7, L. monocytogenes and Salmonella spp., respectively. For all the pathogens, the two duplex, real-time PCR was equally sensitive to uniplex real-time PCR, using same amounts of purified DNA, and allowed detection of 10 genome equivalents. When our established duplex real-time PCR assay was applied to artificially inoculated fresh lettuce, the detection limit was $10^3$ CFU/g for each of these pathogens without enrichment. The results from this study showed that the developed duplex real-time PCR with melting curve analysis is promising as a rapid and cost-effective test method for improving food safety.
더보기본 연구에서는 신선편의 채소와 과일에서 주로 검출되는 대장균(E. coli Ol577:H7), 리스테리아(L. monocytogenes), 살모넬라(Salmonella, spp.), 형색포도상구균(S. aureus)을 검출하고 동정할 수 있는 real time PCR 방법을 melting curve 분석을 활용하여 single tube 반응으로 두 종의 식중독균을 동시 검출하는 방법을 개발하고자 하였다. 대장균의 ${\beta}$-glucuronidase (uidA), 황색포도상구균의 thermonuclease (nuc), 리스테리아의 hemolycin (hly), 살모넬라의 tetrahionate reductase (ttr) 를 특이적으로 검출할 수 있는 4종의 프라이머 세트에 대한 real-time PCR의 melting curve 분석을 통하여 황색포도상구균과 대장균 동시분석 시 $T_m$ 값이 $80.6{\pm}0.9^{\circ}C$와 $86.9{\pm}0.5^{\circ}C$, 리스테리아와 살모넬라 동시분석 시 Tm 값이 $80.4{\pm}0.6^{\circ}C$와 $88.1{\pm}0.11^{\circ}C$로 확인하였고, 그 결과 정제되어진 각 식중독균의 genomic DNA를 주형으로 한 duplex real-time PCR 방법이 uniplex real-time PCR 방법과 마찬가지로 10 genome equivalents 까지 검출할 수 있는 민감도를 나타내었다. 또한, 양배추에 네 종의 식중독균을 접종하고, 증균배양 없이 DNA를 추출하여 duplex real-time PCR 을 수행한 결과 모든 식종목균에서 $10^3$ CFU/g의 검출 한계를 나타내었다. 결과적으로 개발된 melting curve 분석을 이용한 duplex real-time PCR 방법은 식품안전 증진을 위한 시간, 노동력, 비용 절감에 있어서 유효한 방법이 될 것으로 판단된다.
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