흰쥐 샘뇌하수체의 면역전자현미경적 연구 : 젖샘자극호르몬 분비세포와 성장자극호르몬 분비세포 = Immunoelectron Microscopic Study on the Prolactin and Growth Hormone Cells of the Rat
본 실험은 흰쥐 샘뇌하수체의 세포형태를 밝히기 위하여 이중면역금입자표지법을 이용하였다.
체중 200-250g의 Sprague Dewley계 숫흰쥐를 실험동물로 사용하였다. ether로 마취된 후 뇌하수체전엽을 적출하여 1% glutaraldehyde- 1% paraformaldehyde액으로 일차고정하였으며, 2% osmium tetroxide액에 이차고정하였다. 고정이 끝난 조직은 alcohol과 propylene oxide로 탈수한 후 araldite혼합액에 포매하였다. 포매된 조직은 LKB-V ultratome으로 60-70cm두께의 얇은 절편을 작성하여 300 mesh nickel grid에 붙인 다음 면역염색 및 이중면역금입자표지법을 시행하였다.
젖샘자극호르몬에 대한 면역염색은 sodium m-periodate로 45분간 처리한 다음, 비특이적 면역반응을 제거하기 위해서 bovine serum albumin(BSA, Sigma) 1% 용액을 사용하였으며, 완충용액으로는 Tris buffered saline, pH 8.2(TBS; 20mM Tris buffered + 20mM NaCl + 0.01% sodium azide)을 사용하였다. 일차항체는 rabbit anti ovine prolactin(ICN Chemicals)을 1 : 3,000으로 희석하여 사용하였으며, 이차항체는 biotin이 표시된 goat anti rabbit Ig G(희석비율 1 : 500, Amersham)을 사용하였고, 금입자표지는 streptavidin gold(희석비율 1 : 100, 10nm, Amersham)을 사용하였다.
성장자극호르몬에 대한 면역염색은 sodium m-periodate로 45분간 처리한 다음, 완충용액으로는 phosphate buffered saline, pH 7.4(0.01M)을 사용하였다. 비특이적 반응을 줄이기 위하여 100mM ammonium chloride로 처리한 후 rabbit anti human growth hormone(BioGenex)을 1 : 40으로 희석하여 면역 반응을 시킨후, protein A-gold(희석비율 1 : 50, 5 nm, BioCell)로 금입자표지를 하였다.
이중면역염색은 Bendayan(1982)의 방법을 변형하여 시행하였는데, grid의 한쪽 면은 젖샘분비자극호르몬의 항체, 다른 쪽 면은 성장자극호르몬의 항체로 반응시켰다. 면역염색이 끝난 절편은 uranyl acetate와 lead citrate로 염색한 후 JEM 100 CX-Ⅱ 전자현미경으로 관찰하여 다음과 같은 결과를 얻었다.
흰쥐 샘뇌하수체를 이중면역금입자표지법을 이용하여 젖샘자극호르몬분비세포는 3종류, 성장자극호르몬세포는 2종류로 구분할 수 있었다.
1. 젖샘자극호르몬분비세포는 불규칙한 모양을 한 큰 분비과립(300-700 nm)을 가진 성숙세포, 크기가 다양한 둥근 분비과립(150-200 nm)을 가진 중간 세포와 크기가 작은 둥근 분비과립(100-150 nm)을 가진 미성숙세포로 나눌 수 있었다.
2. 성장자극호르몬분비세포는 크고 둥근 분비과립(200-500 nm)을 가진 제 1 형 세포와 상대적으로 작고 둥근 분비과립 (150-200 nm)을 가진 제 Ⅱ형 세포로 나눌 수 있었다.
3. 젖샘자극호르몬과 성장자극호르몬이 한 세포내에 함께 존재하는 경우는 관찰 할 수 없었다.
This experiment was aimed at clarifying immunocytochemical characteristics of growth hormone cells and prolactin cells in male rat adenohypophysis, using double immunogold method. Under ether anestehesia, male rats weighing 200-250 gm were decapitated. Adenohypophysis were fixed in the 1% glutaraldehyde - 1% paraformaldehyde solution. followed by refixation in the 2%osmium tetroxide solution. Dehydrated blocks were embedded in araldite mixture. The sections were cut on a LKB V ultrotome, and ultrathin sections were placed on nickel rid(300 mesh). The section-bearing grids were floated upside down on th esolutions in a moisture chamber at room temperature. Sections were etched with a saturated solution of sodium m-periodate for 45 min. Aftr etching. sections were pretreated with 0.02M Tris buffered saline(TBS), pH 8.4, with 1% bovine serum albumin(BSA, Sigma) for 60 min, then treated with rabbit anti-sheep prolactin(ICN incubated 60 min in biotinylated goat anti-rabbit IgG(Amersham) diluted 1:100 in TBS with 0.1% BSA. Then sections were incubated on streptavidin gold rinsed with TBS with 0.1% BSA. After each step, the grids were briefly rinsed with TBS with 0.1% BSA. After the streptavidin gold step, the sections were jet washed with distilled water.
According to Bendayan(1982) method, the opposite side of the grid was etched with saturated solutin of sodium m-periodate for 45 min. Aftr etching, sections were treated with 0.01M phosphate buffered saline(PBS), pH 7.4, with 0.1% BSA and 0.1M ammonium chloride for 60 min, then treated with rabbit anti-human growth hormone(BioGenex) diluted 1:40 in PBS with 0.1% BSA for overnight. Grids were incubated 60 min in protein A-gold(5 nm, BioCell) diluted 1:50 in PBS with 0.1% BSA. The sections were jet washed with distilled water. The ultrathin sections stained with uranyl acetate and lead citrate were observed with JEM 100CX II electron microscope.
The results were as follow:
Three types of prolactin cells and two types of growth hormone cells of the rat adenohypophysis were recognized by double immunogold electron microscopy.
1. Matrue prolactin cells are characterized by irregulary shaped large secretory granules (300-700 nm): intermediate type cells contain round granules of varying sizes(150-200 nm): and immature type cells have small round secretory granules(100-150 nm).
2. Type I growth hormone cells are characterized by large round secretory granules(200-500 nm): type II growth hormone cells are characterized by large round secretory granules(150-200 nm).
3. In the male rat adenohypophysis double immunogold labeled with 10 nm gold particles for prolactin and with 5 nm gold particles for growth hormone proved that growth hormone and prolactin were not contained in the same cell at the same time.
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