결핵균 단세포군항체에 의한 항산균항원의 면역화학적 분석에 관한 연구 = Studies on the Immunochemical Characterization of Mycobacterial Antigen by Monoclonal Antibodies to Mycobacterium tuberculosis Antigen
β-antigen is one of the major protein of Mycobacterium tuberculosis. We purified reference β-antigen from the unheated culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis by serial ammonium sulfate precipitation, gel filtration on Sephacryl S-200 column and preparative polyacryamide gel electrophoresis. Nine monoclonal antibodies against β-antigen were produced by hybridoma technique. The nine monoclonal antibodies were divided into two groups according to their reaction patterns on Western blots. Four monoclonal antibodies(group Ⅰ) reacted with two major bands of 83 and 52 kDa, and two minor bands of 110 and 56 kDa molecules while the other five monoclonal antibodies(group Ⅱ) reacted with a major band of 83 kDa and a minor and of 110 kDa molecule. The interspecies reactivities of nine monoclonal antibodies on the sonicated antigens from 21 species of mycobacteria were also examined by dot blots. Two monoclonal antibodies, designated 4G5E10(group Ⅰ) and 5F3F2(group Ⅱ), showed a specificity restricted to Mycobacterium tuberculosis complex. β-antigien from the cell extract of Mycobacterium tuberculosis was purified by affinity chromatography with 5F3F2 monoclonal antibody and checked its molecular characterization. Affinity purified β-antigen showed two distinct bands of 83 and 52 kDa molecules on SDS-PAGE. These results indicating that β-antigen is a associated protein with molecular weights of 83 and 52 kDa, and contains at least two different specific epitopes for Mycobacterium tuberculosis complex on β- antigen molecules. Affinity purified and reference β- antigens were applied for its potential diagnostic utility for determination of LgG antibody in the cerebrospinal fluids and sera of tuberculosis patients by ELISA. The mean ELISA values of IgG antibody activities to affinity purified β-antigen at the CSF dilution of 1 : 5 were 0.866±0.607 in 12 patients with tuberculous meningitis and 0.058±0.040 in 24 controls(P<0.001). The mean ELISA values of IgG antibody activities to reference β-antigen at the serum dilution of 1 : 100 were 0.861±0.350 in 97 patients with minimal tuberculosis, 1.052±0.443 in 51 patients with moderately advanced, 1.381±0.396 in 49 patients with far advanced and 0.454±0.248 in 138 controls(P<0.01). An indirect sandwich ELISA using specific biotinylated 5F3F2 monoclonal antibody as tracer was designed to detect β-antigen in the culture filtrate of Mycobacterium tuberculosis and sputum samples from patients with pulmonary tuberculosis. The detection limit of indirect sandwich ELISA was 0.1㎍ culture filtrate/㎖. The mean ELISA values of β-antigen reactivities in sputum samples from 52 patients with pulmonary tuberculosis and 25 controls were 0.766±0.404 and 0.453±0.133(not significant).
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