SCOPUS
KCI등재
Escherichia coli에서 발현된 Recominant Bacillus pasteurii Urease의 정제 및 효소학적 특성 = Purification and Enzymatic Characteristics of the Bacillus pasteurii Urease Expressed in Escherichia coli
저자
발행기관
학술지명
한국미생물·생명공학회지 (Korean Journal of Microbiology and Biotechnology)
권호사항
발행연도
1992
작성언어
Korean
주제어
KDC
570.6
등재정보
SCOPUS,KCI등재
자료형태
학술저널
발행기관 URL
수록면
519-526(8쪽)
제공처
소장기관
Bacillus pasteurii의 urease gene이 Escherichia coli HB101에서 발현된 Bacillus성 recombinant urease를 단일단백으로 정제하고 그 효소학적 특성을, 별도로 정제한 B. pasteurii urease의 그것과 비교검토하였다.
B. pasteurii urease gene이 cloning된 E. coli HB101(pBU11)의 균체파쇄액으로 부터 TEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-150, Sephadex G-200 등의 이온교환 크로마토그래피와 gel filtration을 이용하여 E. coli내에서 발현된 B. pasteurii성 recombinant urease를 비활성도 기준 63.1배까지 정제하였으며, 또한 B. pasteurii로부터도 비활성도 185.2배의 urease를 정제하여 disc gel electrophoresis로 단일 단백으로 정제되었음을 확인하였다. 정제된 두 urease들의 native 상태의 분자량은 공히 280,000±10,000 정도로 확인되었고, SDS-electrophoresis에 의해 subunit 유무와 분자량을 확인한 결과도 67,000 정도의 subunit 4개와 20,000의 subunit 1개로 된 α_4β구조의 동일한 효소단백으로 추정할 수 있었다.
Gene donor인 B. pasteurii와 cloning된 균주 E. coli(pBU11)이 생산한 두 urease의 효소학적 특성을 비교 조사해본 결과 두 urease의 최적반응 pH는 공히 7.5로 나타났으며, pH에 대한 안정성도 두 urease가 공히 pH 5.5에서 10.5 사이에서 50% 이하로 활성이 떨어지지 않는 강한 pH 안정성을 보였다. 두 urease의 최적반응의 온도는 60℃였으며, 비교적 온도에 대한 저항이 강한 효소임을 알았다. 두 urease의 활성에 미치는 금속이온의 영향은 Ag^2+, Hg^2+ 등에서 양효소가 모두 강한 저해현상을 받는 반면, Mn^2+, Mg^2+에서는 다소 촉진되는 현상을 보였다. 효소반응 저해제들의 영향을 조사해 본 결과 ρ-CMB, acetohydroxamic acid에 두 urease가 모두 강한 저해를 받았다. 두 urease의 K_m값과 V_max값은 E. coli(pBU11)의 urease는 4.21×10^-2 mol/ℓ, 86.96 μmol/min이었고, B. pasteurii urease는 4.04×10^-2 mo1/ℓ, 160 μmol/min이었다. 따라서 B. pasteurii의 urease나 그 urease gene으로 cloning되어 E. coli내에서 발현된 recombinant urease는 분자량이나 효소학적 특성에서 거의 동일한 효소단백임을 알 수 있었다.
The gene coding for urease of alkalophilic Bacillus pasteurii had been cloned in Escherichia coli previously. The urease protein was purified 63.1-fold by TEAE-cellulose, DEAE-Sephadex A-50, Sephadex G-150 and Sephadex G-200 chromatographies with a 7.3% yield from the sonicated fluid of the E. coli HB101(pBU11) encoding B. pasteurii urease gene. The ureases of E. coli (pBU11) and B. pasteurii possessed as a K_m for urea, 42.1 mM and 40.4 mM, respectively. They hydrolyzed urea with V_max of 86.9 μmol/min and 160 μmol/min, respectively. Both ureases were composed with four subunits (Mrs 67,000) and a subunit (Mr 20,000). The molecular weight of both native enzymes was Mr 280,000±10,000 determined by gel filtration chromatography and Coomassie blue staining of the subunits. The optimal reaction pH of both ureases were pH 7.5. The ureases were stabled in pH 5.5∼10.5. The optimal reaction temperature of both ureases were 60℃, and the ureases were stable for an hour at 50℃, 40min at 60℃ and 10min at 70℃ The activity of both enzymes were inhibited completely by Ag^2+, Hg^2+, Zn^2+, Cu^2+, and were inhibited 60% by Co^2+, 30% by Fe^2+ and 10% by Pb^2+. However it was increased by the addition of Sn^2+, Mn^2+, Mg^2+ at concentration of 1×10^-3 M. Both ureases were inhibited completely by ρ-CMB and atetohydroxamic acid. The urease expressed in E. coli (pBU11) was inhibited 70% by SDS. The urease of B. pasteurii was inhibited 40% by hydroxyurea, whereas the recombinant urease of E. colistrain was inhibited 17%. Both enzymes were not inhibited by cyclohexanediaminetetraacetic acid(CDTA) and ethylendiaminetetraacetic acid (EDTA).
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