Protein Phosphatase의 억제와 Protein Kinase C의 활성이 Collagen 합성 및 유전자 발현에 미치는 영향 = Effects of Okadaic Acid and Phorbol Myristate Acetate on Collagen Synthesis and α_1(Ⅰ)Procollagen mRNA Levels in Various Cell Lines
목적 : 이 연구는 섬유아세포에서 collagen유전자 발현을 조절하는 기전을 밝히는 노력의 일환으로 세포내 단백질의 인산화에 중요한 역할을 하는 protein phosphatase의 길항제이며 non-phorbol ester tumor promoter인 okadaic acid(OKA)와 protein kinase C의 활성제인 phorbol myristate acetate(PMA)가 정상섬유아세포를 비롯한 수종의 서로 다른 특성의 세포에서 collagen합성 및 유전자 발현에 어떤 영향을 미치는가를 조사하였다.
재료 및 방법 : 각종 섬유아세포 즉 사람 폐섬유아세포인 HEL 299 세포, 골아세포인 MC3T3-El세포, 생쥐 섬유아세포인 NIH3T3 세포, 사람피부섬유아세포인 HSF30세포, keloid 섬유아세포를 비롯하여 마우스 정상 섬유아세포인 Balb/c 3T3 세포를 virus로 형질전환시킨 K-balt세포, SV-T2 세포 및 M-MSV-BALB 세포 등을 적당한 조건하에 배양하여 일정한 상태로 만들고 배양액에 protein Phosphatase의 억제제인 OKA와 protein kinase C의 활성제인 PMA를 일정한 조건으로 첨가하고서 ^3H-proline을 넣어서 총 단백질과 collagen에 편입되는 방사능의 정도를 측정하여 이들의 collagen 합성에 미치는 영향을 산출하였다. 또 이들의 영향이 유전자 수준에서 작용하는지를 조사하기 위하여 Chomczgynski와 Sacchi법에 의한 총 RNA의 수출, Thu등과 Feinberg 및 Vogelstein법에 따라 northern blot hybridization을 실시하고, Labarca 및 Paigen의 방법을 이용하여 DNA양을 측정하였다.
결과 : OKA와 PMA는 세포마다 정도의 차이는 있지만 collagen합성을 농도에 비례하여 억제되었으며, 그리고 OKA의 효과는 PMA에 의해 증대되었다. OKA의 collagen합성억제 효과는 반응 12시간 뒤에 나타났으며 PMA의 효과는 반응 3시간째에 나타났다. 이것은 OKA와 PMA의 collagen합성에 대한 작용기전의 다름을 시사한다. 또한 OKA와 PMA은 정상 섬유아세포의 α_1,(Ⅰ)procollagen mRNA치를 현저히 감소시켰으며 이것은 OKA와 PMA의 collagen합성 억제작용이 유전자 발현의 억제에 의한 것임을 뜻한다. Collagen 합성이 정상 보다 현저히 증가된 keloid세포에서도 OKA와 PMA는 모두 상대적 collagen합성을 감소시켰다. 바이러스로 형질전환시킨 세포에서는 OKA와 PMA에 대한 반응이 이질적으로 나타나 형질 전환과정에서 생긴 세포내의 변화가 OMA와 PMA의 collagen합성조절 기전에 영향을 주었음을 시사한다.
결론 : 이상의 결과를 종합하면 OMA와 PMA는 둘다 결합조직세포의 α_1,(Ⅰ)procollagen 유전자발현을 억제함으로써 collagen합성을 감소시켰으나 그 작용양상은 달라서 서로 다른 기전으로 작용한다 할 수 있다. 또한 형질전환세포에서 OKA와 PMA의 collagen합성에 대한 작용이 이질적으로 나타나 이들의 collagen합성에 대한 작용이 세포의 형질전환고정에서 역시 서로 다른 영향을 받는다고 할 수 있다.
In this study, effects of two well known chemicals to affect intracellular signal transduction pathways, okadaic acid (OKA), a protein phosphatase inhibitor, and phorbol myristate acetate (PMA), a protein kinase C activator, on collagen synthesis and mRNA levels in various cell lines were evaulated.
Both of OKA and PMA inhibited collagen synthesis in a dose-dependent manner in several fibro blasts and osteoblast. In human fibroblasts, a suboptimal dose of PMA potentiated the inhibitory effect of OKA on collagen synthesis. Time couse study, however, showed that OKA inhibited collagen synthesis at 12 h and PMA at 3 h after treatment indicating that OKA and PMA may affect colla gen sythesis by different pathways. Northern blot anaysis showed that both of OKA and PMA decreased α_1[Ⅰ]procollagen mRNA levels in human fibroblasts and in this effect, they did not require a new protein synthesis. OKA and PMA also decreased collagen sythesis in several keloid fibroblasts of which collagen synthetic acitivities were elevated. In virally transformed fibroblasts, however, OKA and PMA showed quite different effects on collagen synthesis suggesting that intracellualr changes in the processes of viral transformation might effect the regulatory mechanisms of collagen synthesis and thus affect collagen synthesis in responses to OKA and PMA.
Taken together, both of OKA and PMA inhibited collagen synthesis in several different cell lines but their actions were different mechanisms.
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