Protein methylase Ⅱ (S-adenosy-L-methionine : protein-carboxyl 0-methyltransferase) has been, purifed 6,600-fold from bovine skeletal muscle and characterized. The purification procedures involved ammonium sulfate fractionation, Sephadex G-75 chromatography, S-adenosyl-L-homocysteine-Sepharose 4B chromatography, and hydroxyapatite chromatography.
The enzyme showed an optimal pH around 6.0. It was heat-labile, being inactivated by heattreatment at 60℃ for 6 minutes. However, storage of the enzyme at -20℃ in the presence of 10% glycerol prevented the activity loss for 6 months.
The apparent Km for S-adenosyl-L-methionine was 2.86 × 10 exp (6) M. Copper(Cu^2+) ion was potent noncompetitive inhibitor, the activity being completely inhibited b) 0.25 mM Cu^2+ and 1 mM Zn^2+. Most of the activity loss by copper and zinc ions were recovered by the addition of ethylenediamine tetracetate. The enzyme was also completely inhibited by 0.5 mM phydroxymercuribenzoate, which could be reversed by the addition of 10 mM 2-mercaptoethanol.
The molecular weight of the enzyme was 24,000, as determined by Sephadex G-75 chromatography. Histone IIA, immunoglobulin A and soybean trypsin inhibitor were efficiently carboxylmethylated by the enzyme.
Sarcoplasmic reticulum(SR) and sarcolemma(SL) of the skeletal muscle were also efficiently carboxylmethylated by the enzyme at a rate of 0.96 and 0.63 pmolesl mg protein/min of 3^H-CH_3, incorporation, respectively.
Polyacrylamide gel electrophoresis of the carboxylmethylated SR and SL revealed multiple carboxylmethylated subfactions : SR resolved into the subfractions with molecular weight 100,000, 55,000, 22,000 and 14, 400, and SL into the subfractions with molecular weight 48,000, 22,000 and- 14, 400. Of these subfractions those with Mr=22, 000 were most strongly carboxylmethylated.
Endogenous cAMP-dependent phoshorylation of SR occurred in the subfractions with Mr=55, 000, Mr=27, 000 and Mr=~14, 400, of which the fraction with Mr=27, 000 was most strongly phosphorylated. When SR was carboxylmethylated, the endogenous cAMP-dependent phosphorylation was decreased.
SR exhibited relatively high Ca^2+-ATPase activity and oxalate-facilitated ATP-dependent 45^Ca^z+uptake. The carboxylmethylation and cAMP-dependent phosphorylation of SR increased the Ca^2+TATPase activity by 15% and by 29%, respectively. However, cAMP-dependent phosphorylation of SR which had been previously carboxylmethylated led to only 23% increase in the Ca^2+-ATPase activity.
Both the carboxylmethylation and cAMP-dependent phosphorylation enhanced the steady-state rate as well as the initial rate of ^45Ca^2+-uptake. Kinetic analysis showed that the apparent Km and Vmax of Ca^2+ for ATP-dependent Ca^2+-uptake were 45μM and 35 nmoles/mg protein, respectively. Both the carboxylmethylation and cAMP-dependent phosphorylation of SR decreased the Km and increased the Vmax for the Ca^2+-uptake.
These results suggest that protein methylase II might have some regulatory role in the calcium transport of sarcoplasmic reticulum.
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