Bacillus subtilis JK-56이 생산하는 chitinase isozyme의 정제와 특성 규명 = Purification and characterization of the chitinase from Bacillus subtilis JK-56
토양으로부터 chitinase를 생성하는 균주를 분리하여 동정한 결과 Bacillus subtilis로 판명되었으며, 분리한 균주를 Bacillus subtilis JK-56이라 명명하였다. B. subtilis JK-56의 chitinase 생산 최적 조건을 검토한 결과 1% chitin, 0.5% polypeptone, 0.1% KCl, 0.05% MnSO_4 · 4H_2O이며 초발 pH 7.0, 배양온도 37℃에서 가장 많은 효소를 생산하였다. 본 균주가 생산하는 chitinase를 정제하기 위해서 native-PAGE를 이용해 효소활성 band를 확인한 결과, 1개의 강한 활성 band와 2개의 약한 활성 band를 가지는 isozyme중 1개의 강한 활성 band를 정제하였고 정제된 효소를 Chi-56A라고 명명하였다. Chi-56A의 효소 특성에 관해서 실험한 결과 분자량은 약 53kDa, pl는 4.3으로 확인되었다. 본 효소는 65℃까지 상당히 안정하였으며 효소의 최대활성 온도도 65℃로 확인되는 등 열에 대해 상당히 안정한 효소로 확인되었다. Collidal chitin에 대한 정제효소 Chi-56A의 K_m값은 17.33g/L였다. 그리고 pH 6.0에서 최대의 활성을 나타내었고, 산성범위보다 알칼리범위에서 안정한 것으로 나타났다. 또한 Mn^2+ 존재 하에서 높은 활성을 나타내었고 Co^2+와 Mg^2+ 존재 하에서도 활성이 약간 증가한 반면에 Hg^2+ 존재 하에서는 상당한 저해를 받았다. Chito 올리고당에 대한 분해 산물을 HPLC로 확인해 본 결과 짝수개의 올리고당의 분해산물은 (GlcNAc)_2만을 생산하였고 홀수개의 올리고당에 대해서는 GlcNAc와 (GlcNAc)_2를 생산하는 것으로 비환원성 말단으로부터 이당체인 diacetyl chitobiose ((GlcNAc)_2)를 생산하는 exo형 chitinase로 추정된다.
더보기Chitin, a β-1,4 polymer of N-acetyl-D-glucosamine, is one of the most abundant organic compounds in nature. Chitinase (EC 3.2.1.14) is an enzyme that degrades chitin to chito-oligosaccharides, diacetyl chitobiose and N-acetyl-D-glucosamine. An extracellular chitinase-producing bacterial strain was isolated from soil and named to as Bacillus subtilis JK-56. Optimum culture condition of B. subtilis JK-56 for the production of chitinase was 1% chitin, 0.5% polypepton, 0.1% KCl, 0.05% MnSO_4 · 4H_2O, 37℃, initial pH 7.0 and 40 hour culture time. When B. subtilis JK-56 was grown in the optimum medium, one major active band and two minor active bands were detected by native-PAGE and active staining of the gel. Among them, the major band was purified from the culture supernatant by 70% ammonium sulfate precipitation and native-PAGE with BIO-RAD Model 491 Prep-Cell and named as Chi-56A. Its molecular weight was estimated to be 53kDa monomer and the isoelectric point (pl) was pH 4.3. The pH and temperature for the optimum activity of Chi-56A were pH 6.0 and 65℃, respectively. Chi-56A was stable up to 65℃ and in alkaline region. Its K_m value for colloidal chitin was 17.33g/L. HPLC analysis of the reaction products confirmed that Chi-56A was an exo type chitinase.
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