Cloning, Overexpression and Purification of the Heat Shock Protein Hsp58, a Common Antigen of Leptospira Species = 렙토스피라균종의 공통항원 Heat Shock Protein 58의 클론닝, 과량발현, 정제
저자
Kim, Min Ja (Department of Life science and Biotechnology, Graduate School of Biotechnology, Korea University) ; Park, Seung Chul (Department of Internal Medicine, College of Medicine, Korea University) ; Park, Se-Hoon (Department of Life science and Biotechnology, Graduate School of Biotechnology, Korea University) ; Ahn, Byung-Yoon (Department of Life science and Biotechnology, Graduate School of Biotechnology, Korea University)
발행기관
학술지명
권호사항
발행연도
1998
작성언어
English
주제어
KDC
513.90
자료형태
학술저널
발행기관 URL
수록면
332-341(10쪽)
제공처
목 적 : 렙도스피라증에서 숙주의 체액성 면역반응은 필수적인 방어기전으로 이에 관련된 렙토스피라 항원들의 특성을 규명하는 것은 이 질환의 발병기전과 진단시약의 개발, 그리고 면역형성의 이해에 매우 중요하다. 지금까지 렙토스피라 lipoplysaccharide는 혈청내에서 응집항체나 옵소닌 작용을 유도하므로써 방어적 항원의 하나로 확인되었으며, 그외에 외막단백 및 편모 등의 외피성분들도 면역항원의 일부로 여겨지고 있으나 체액성 면역형성에 관려된 단백항원들은 아직 명백히 규명되지 않았다. 본 연구의 목적은 체액성 면역형성에 관련된 주 단백항원을 클론하고, 그 유전자적 구조를 밝히고, 그 재조합단백항원을 과량발현하고 분리정제하여 보다 향상된 진단 항원으로서의 개발 가능성을 알아보고자 하였다.
방 법 : 국내 분리균주 Leptospira interrogans serovar lai (HY-1 strain)의 genomic library로부터 immunoblot방법으로 환자의 회복기 혈청과 강하게 반응하는 E. coli 클론들을 선별한 후, 그 중 약 62 KDa 의 Leptospira 단백항원을 발현하는 E. coli 발현 vector에 클론된 subclone pET-58에서 이 단백항원의 과량발현을 유도하고, 순수분지정제하여 가토에 면역하여 다가항체를 생산하였고, 다양한 Leptospira균종들에서 이 단백항원의 보존 유무를 immunoblot으로 확인하였다. 다음 단계에서 재조합단백항원을 이용한 strip immunoblot을 실시하여 렙토스피라증 환자 혈청내의 항체반응을 조사하였다.
결 과 : 환자의 회복기 혈청과 강하게 반응하는 62 KDa의 Leptospira 단백항원 유전자의 DNA 염기배열을 결정하고 아미노산 배열을 유추한 결과, 이전에 보고된 열 충격에 의해 발현이 유도되는 Hsp60 family과 높은 상보성을 보이는 Hsp58 homolog로 밝혀졌다. Subclone pET-58로부터 과량발현된 재조합 pET-58은 환자 혈청과 강하게 반응하였으며, pET-58은 다양한 Leptospira균종들에서 보존되어 있었다. 재조합 pET-58 항원은 특이하게 렙토스피라증 환자의 혈청에만 반응하였고, 특히 강한 IgG 항체 반응을 보였으나 IgG 항체반응은 보이지 않았다. 정상인 혈청에는 반응하지 않았다.
결 론 : 본 연구의 결과에서 Leptospira pET-58 항원은 자연감염 후 유도되는 체액성 면역반응에서 작용하는 주요 단백항원의 하나임을 규명되었다. 재조합 Hsp-58단백항원의 진단적 혹은 임상적 적용을 조사하기 위하여 향후 더 많은 연구가 필요할 것으로 사료된다.
Background : Humoral immune response is essential for resistance against leptospirosis, and the antigens involved in the response might be responsible for pathogenesis, diagnosis or immunity. The aim of this study is to clone, overexpress and purify one of leptospiral protein antigens recognized by patients' sera and elucidate it as a diagnostic antigen.
Methods : We isolated a reactive clone LIA5 from a genomic library of Leptospira interrogans serovar lai which expressed a 62 kDa protein co-migrated to a predominant protein of Leptospira by immunoblotting with patients' sera. The sequence of the clone with 2.7 kb leptospiral DNA was determined. The 62 kDa protein encoded by an open reading frame with 1,637 bp was overexpressed in I. coli by pT7 expression vector, and purified to homogeneity by Ni-affinity resin and further electroelution. Patients' sera were examined for IgM or IgG antibodies reacting with the recombinant antigen by strip immunoblotting.
Results : Sequence analysis of the clone identified two genes homologous to the hsp58 and hsp10 of Leptospira serovar copenhageni, homologues of E. coli heat shock protein genes groEL and groES, respectively. The Hsp58 protein was detected commonly in several leptospires by immunobloting with both patients' sera and rabbit anti-Hsp58 antibody raised against the purified recombinant Hsp58 protein (rHs58). The predominant class of reacting antibody against rHsp58 in in patients' sera was IgG.
Conclusion : The results indicate that Hsp58 is a highly conserved, doninant antigen in humoral immune response to leptospirosis. Further studies are needed to test the rHSP as an immunodiagnostic antigen.
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