Single-molecule studies on helicase activity

다국어 초록 (Multilingual Abstract)

The human genome contains five genes encoding RecQ helicase family proteins, enzymes that play diverse and non-redundant roles in genome maintenance. The heritable disease syndromes—Bloom’s syndrome, Werner syndrome and Rothmund Thomson syndrome, each with distinct clinical features—have been linked to mutations in three of the human RecQ helicases: BLM, WRN, and RECQL4, respectively (Bohr, 2008; Ellis et al, 1995; Kitao et al, 1999; Kudlow et al, 2007; Yu et al, 1996) . It is currently not known whether the distinct clinical features of these diseases reflect different characteristic protein interactions, or fundamental differences in the enzymatic mechanisms. To address this question, we used single-molecule fluorescence resonance energy transfer to analyze the DNA unwinding activity of Werner syndrome protein. As also reported in a recent study on BLM, WRN exhibited repetitive unwinding whose kinetics was significantly modulated by RPA. However, contrasted to BLM which switched translocating strands during repetitive unwinding, WRN switched its enzymatic activities between unwinding and annealing modes. The activity switching occurred at well-defined positions, suggesting that WRN maintains an anchoring point during repetitive unwinding. Binding of the multiple RPAs to WRN resulted in a significant increase of WRN processivity, implying release of the anchoring. The mechanistic differences between BLM and WRN revealed in this work request further comparative studies on the unwinding mechanisms of different RecQ homologues.

국문 초록 (Abstract)

인간의 genome은 RecQ helicase family에 속하는 다섯 개의 단백질을 포함하고 있는데, 이들은 genome의 유지, 보수에 중요한 역할을 하며 그 역할에 있어서 자기 만의 고유한 몫을 담당하고 있기도 하다. 이 유전 질환은 (Bloom, syndrome, Werner syndrome, Rothmund Thomson syndrome) human RecQ helicase들인 BLM, WRN 그리고 RECQL4 단백질의 변이와 각각 관련되어 있다. 그러나 이러한 증후군들의 임상학적 차이들이 과연 이 단백질들과 다른 단백질들과의 상호작용의 차이에서 오는 것인지 아니면 단백질의 enzymatic mechanism의 근본적인 차이에서 오는 것인지는 아직 밝혀지지 않고 있다. 이 문제에 대한 접근으로, Werner syndrome 단백질의 DNA 풀림 작용을 분석하기 위해서 single-molecule fluorescence energy transfer (FRET) 을 이용하였다. 최근에 발표된 BLM helicase에 관한 실험 결과에서와 같이 WRN 또한 반복적인 unwinding을 보였으며, 이는 RPA (replication protein A) 에 의해서 unwinding 의 kinetics가 영향을 받았다. 그러나 반복적인 unwinding 중 돌아오면서 반대쪽 strand로 translocating strand를 바꾸었던 BLM과는 다르게 WRN는 단지 unwinding 과 annealing 사이에서 mode가 바꾸는 양상을 보였다. 두 activity 상의 변환은 거의 일정한, 정해진 위치에서 일어났으며 이는 WRN가 반복적인 unwinding 동안에 어딘가에 anchoring 해 있다는 것을 의미한다. 또한 여러 개의 RPA가 WRN에 붙음으로써 WRN의 unwinding processivity가 매우 증가하는 것을 볼 수 있었는데, 이는 anchoring 하고 있는 것을 놓게 되는 것을 의미할 수 있다. 이 연구에서 밝혀진 WRN와 BLM의 mechanism의 차이에 대해서는 더 많은 추가적인 실험이 요구된다.

목차 (Table of Contents)

• Abstract
• Contents
• List of Figures
• CHAPTER1. Single Molecule FRET
• 1.1. RecQ Helicases in Genome Maintenance
• 1.2. Fluorescence Resonance Energy Transfer
• 1.3. Single Molecule FRET Study on RecQ Helicases
• REFERENCES
• CHAPTER2. Processivity Increase of WRN by RPA Multiple Binding
• 2.1. Results
• 2.1.1. Repetitive Unwinding Behavior of WRN Helicase
• 2.1.2. Physical interaction between WRN and RPA
• 2.1.3. Full Unwinding of Long Duplex DNA Fork
• 2.2. Discussion & Conclusion
• 2.3. Material & Methods
• REFERENCES
• CHAPTER3. Mode Switching of WRN during Repetitive Unwinding
• 3.1. Results
• 3.1.1. ATP and ATPgS Effect on WRN Helicase Unwinding
• 3.1.2. Test of Strand Switching Model
• 3.2. Discussion & Conclusion
• 3.3. Experimental Design
• REFERENCES
• Appendix. Frameshifting RNA Structures of Human Immunodeficiency Virus
• A.1. Introduction
• A.2. Experimental scheme
• A.3. Results
• A.4. Conclusion
• A.5. Materials & Methods
• REFERENCES